几株硝化菌的筛选及其初步鉴定_郑金来

几株硝化菌的筛选及其初步鉴定郑金来　李君文　晁福寰　王新为周　娟　宋　农　古长庆(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津,300050)　　摘要　目的:筛选、分离能够用于治理氨氮污染和军事坑道生活污物、污水的硝化菌。方法:通过富集培养从土壤中筛选的硝化菌,在进行形态学检验和硝化速率测定后,设计引物扩增硝化菌的特征性基因NorB,随机选择一个PCR产物进行测序,并与Genbank上的序列比较同源性。结果:筛选到7株能够降解亚硝酸盐的细菌,经革兰氏染色后发现全部为阴性,其菌落形态以小、圆、淡黄色为主,细菌形态多为短杆状;各菌株的硝化速率在4.35～4.80(mg·L-1·d-1)之间。用PCR均能扩增出预期大小片段。对其中的某一个PCR产物直接测序,与Genbank中的序列比较,发现该基因与硝化菌N.hamburgensis的Norb基因同源性高达99%。结论:可以初步断定,我们所筛选到的菌为硝化菌。　　　　关键词:　硝化菌,　PCR,　Norb基因　　　　　中图分类号:R117　　文献标识码:A　　文章编号:1001-5248(2002)03-0182-03　　硝化菌是一类革兰氏阴性菌,由两类不同的生理群组成:能够氧化氨氮为亚硝酸盐氮的是亚硝酸菌;能够氧化亚硝酸盐氮为硝酸盐氮的是硝酸菌。硝化菌在氮元素的整个循环过程中起着非常重要的作用〔1〕。许多污水处理厂之所以能够去除污水中的氨氮,硝化菌可谓功不可没。在当前氮污染严重的情况下,硝化菌具有实际应用意义,有必要对其进行研究。　　我军同样面临着氮污染严重的问题。在坑道等特殊军事环境下,有效处理富含氮的生活污物、污水是改善坑道部队生活条件、维持空气清新、保障部队健康和战斗力的有效措施之一。因此,为了能够治理环境中严重的氮污染及处理坑道等特殊军事环境中的生活污物、污水等,我们从环境土壤中筛选、分离硝化菌,经过生理、生化、PCR、测序等技术鉴定其种属,并研究其降解环境中氨氮或亚硝酸盐氮的能力,以期能够应用该种微生物控制氮污染,或处理特殊军事环境氮污染提供依据。1　材料与方法1.1　材料　pyrobestDNA聚合酶和dNTP等,均为Taraka产品;DL2000Marker,华美生物技术公司产品;PE2400,美国PE公司产品;台式离心机,军事医学科学院院实验仪器厂产品;电泳仪和水平电泳槽,六一仪器厂产品。1.2　硝化菌的筛选〔2,3〕　通过富集培养和平板划线从土壤中分离获得7个纯的菌落,编号依次为X1-X7。观察菌落形态,革兰氏染色,并在1000×显微镜下观察细菌形态。研究中所用硝化菌培养基的主要组分为:NaNO21g,Na2CO31g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.4g,H2O1000ml,pH7.2。1.3　硝化速率的测定　将上述菌接种在液体培养基中,28℃,黑暗培养60d。用酚二磺酸比色法测量培养基中亚硝酸盐的含量,按下列公式计算其硝化速率:硝化速率(mg·L-1·d-1)=对照组NO-2含量-实验组NO-2含量培养时间1.4　PCR检测NorB基因〔3～4〕　模板的提取采用酚、氯仿、异戊醇提取法。应用Oligo5.0设计引物,·182·解放军预防医学杂志　2002年6月第20卷第3期　JPrevMedChinPLA　June2002　Vol.20No.3DOI:10.13704/j.cnki.jyyx.2002.03.011引物由Takara公司合成。　正向引物序列:5'AAATGGGGAACGCTGAGCA　反向引物序列:5'GCCCCACTTCT