电渗析技术在脱氧核糖核酸在线富集芯片中的应用

第41卷2013年2月分析化学(F踯ⅡHUAⅪJE)研究报告ChmseJo砌alofAnal扣calCh眦is时第2期242～246DOI：10．3724／SP．J．I∞6．加13．2惦砖电渗析技术在脱氧核糖核酸在线富集芯片中的应用黄华斌1庄峙厦Ⅵ胡佳1杨朝勇2王小如11(厦门华厦职业学院检验与科学技术系，厦门361024)2(厦门大学化学化工学院，厦门361005)摘要基于电渗析技术，制作了一种“三明治”式的膜分离微流控芯片，用于脱氧核糖核酸(DNA)的无损伤在线富集。以花菁类染料为荧光指示剂，实现DNA在此芯片中的在线富集观测；分别以^一DNA和A-DNA-血红蛋白混合体系为模型化合物，探究其在此芯片中的富集特性；对浓缩液进行凝胶电泳实验，以考察DNA是否变性，并进行聚合酶链反应，以证明本芯片回收的DNA可供进一步的生物分析。结果表明：以花菁类染料为荧光指示剂，本芯片成功实现聊她的在线富集观测；本芯片能够无损伤捕获并浓缩单一体系和简单混合体系中的DNA分子，DNA的富集倍数近50倍，回收率约30％，浓缩液可用于进一步的生物分析。关键词电渗析；脱氧核糖核酸；富集；微流控芯片1引言目前，针对微流控芯片分析系统中的样品预处理方法和技术的研究已成为分析化学的研究热点之一【I刘。与宏观体系纯化不同的是，在微流控芯片系统中，由于微体系的缩微化，大大减小了样品及试剂的用量，缩短了纯化浓缩所需要时间，提高了实验效率。已经有多种相关的方法和技术的报道盱81，如基于电驱动阴的场放大堆积、等速电泳、等电聚焦技术；以及基于固液双相相互作用的过滤、膜分离、固相萃取等。固液双相分离富集是一种既可实现待测物的浓缩富集又能够去除杂质组分干扰的样品预处理技术，而且它比较容易与微流控芯片系统结合实现芯片上操作o01。膜分离技术在微流控芯片系统中主要用于生物样品中小分子与大分子组分之间的分离富集。Kh锄du血a等【lI】在利用电泳对试样中脱氧核糖核酸(DNA)组分进行分析之前，在试样口与侧通道之间加装了硅酸钠多孔膜。该膜允许溶剂和小分子通过，DNA则被阻挡、聚集，而导致浓度不断提高。该膜的引入使DNA的富集倍数提高了两个数量级。本研究在原有工作的基础上嘲，集成膜分离与电驱动技术至微流控芯片上，构建可用于DNA分子纯化浓缩的预处理芯片；此芯片基于阳离子交换膜对DNA的截留，以恒流泵为液流驱动力，有效设计并利用流路死体积，在芯片上构建“三明治”式的DNA无损伤捕获浓缩装置，并实现荧光在线富集监测。2实验部分2．1仪器与试剂微注射泵(HARvARDP髓2000INFuSION)，m』-2恒流泵(上海沪西分析仪器厂)；稳压直流电源(上海力友电气)；PowerPacB骶ic凝胶电泳仪(BIO一黜～D)；ND-1000全波长紫外何见光扫描分光光度计(Th锄。公司)；凝胶成像系统(美国龇公司)；PCR仪(BIO．m①)；Sp硫激光仪；热压键合机(ⅣC—looO)；荧光显微镜(Nikon公司)；铂金电极，N缅onll35阳离子交换膜(DIlPont)。聚甲基丙烯酸甲酯(P^仰嗄A，2I姗，深圳日昌有机玻璃化工有限公司)。A-DNA(0．3mgDNA／mL，MBI)，啪DNA聚合酶(Promega)，琼脂糖(LP0028A，英国Oxoid公司)；脱氧核糖核酸(dNrP)(P∞mega)，溴化乙锭(s锄gon生物公司)；其它试剂均为分析纯，超纯水由Milli—Q制得(182MQcm)；50bpLadder(Ti趾g％公司)。阴极缓冲液：TE缓冲液(10聊nol几Ths—Hcl，1r姗ol几E肌A．2Na，pH8．0)；阳极缓冲液(1眦∞儿KH2P04+35删n0儿K2Ⅲ’04+l锄。儿Na2S04，pH9．0)；A—DNA扩增片段包括10lbp；正引物57．TAA2012一05-3l收稿；2012．08-31接受本文系国家“863”计划(N02007从09zll5)项目资助+E-ⅡIail：殛吐uang@xn砒．edu．cn万方数据第2期黄华斌等：电渗析技术在脱氧核糖核酸在线富集芯片中的应用243GCACGAACTCAGcCAGAAcGA．3’；反引物5’一CAA(K=TTrGCCAcACCACGGTA丌-3’(Pro—mega)。2．2“三明治”式芯片的设计与制作微流控芯片的通道由聚甲基丙烯酸甲酯(P^n必)经过激光刻蚀后封接而成。图1为上下两层芯片通道示意图。图1a由图2中的C1，C2和C3按照顺序从上到下热压封接而成，由于要翻面覆盖在图lb上，所以在刻蚀cl，C2和C3时，应选择镜像模式。在图1b片下方，由图2中的d1，d2，d3按顺序从上到下热压封接得到。图1中的线条为芯片的微通道，阴影部分是为刻蚀出凹槽便于膜的嵌入，与通道连接的较小圆环为液流进出口，四角上较大圆环是便于