嗅味物质对铜绿微囊藻的溶藻效应

第4期张可佳，等：嗅味物质对铜绿微囊藻的溶藻效应1715类、酮醇、萜类化合物等[5]。蓝藻代谢的嗅味物质多为萜类化合物和脂肪酸，如2-MIB、β-环柠檬醛、β-罗兰酮、庚醛等[6]；而有些嗅味物质是非萜类化合物，如甲硫醚、二甲基三硫醚等。这些嗅味物质除了是造成饮用水异嗅异味的主要来源[7]之外，其特殊的化学特性也可能影响藻类自身的生长代谢。在国内外，具体哪些嗅味物质对蓝藻具有抑制效应及抑制程度尚未进行过系统研究。因此，本文作者考察不同的嗅味物质对自身藻体的溶藻效应，根据表观分析和仪器测定找出对蓝藻溶藻作用较大的嗅味物质，并确定其导致溶藻的界限浓度，从而从机理上分析蓝藻在自然环境中维持平衡的原因，为后续生物控藻技术的发展提供理论支持。1材料与方法1.1实验药剂与材料标准品β-环柠檬醛、β-紫罗兰酮、甲硫醚、二甲基三硫醚和庚醛为色谱纯(纯度>90%)，购自Sigma(美国)、Aldrich(美国)、Fluka(日本)等公司。铜绿微囊藻藻种Microcystisaeruginosa(905)，购自中科院水生生物研究所，培养基为BG11，光照度为2000lux，光暗周期为12h:12h，培养温度为25℃。实验用水为Milli-Q超纯水(电阻率为18.2MΩ·cm)。1.2试验方法待培养的铜绿微囊藻处于稳定期，OD680为0.712，细胞密度为4.7×109L−1。分别取200mL藻液到500mL的玻璃三角锥瓶中，共6份，编号为0号、1号、2号、3号、4号和5号。用铝箔纸盖上瓶盖，防止外部杂质进入；并在上面扎一些小孔，以保证藻液与外界空气流通。其中0号为空白样品，1号、2号、3号、4号和5号分别加入200μL的嗅味物质标准品β-环柠檬醛、β-紫罗兰酮、甲硫醚、二甲基三硫醚和庚醛，浓度为1g/L。放置培养箱中(25℃恒温)，分别于1，3，8，18，30和92h，测定吸光度AOD680和光能利用率α。用0.45μm的乙酸纤维滤膜过滤藻液，用HPLC测特定时刻滤液的微囊藻毒素LR，即得到胞外藻毒素LR的浓度变化情况。考察不同浓度的β-环柠檬醛对铜绿微囊藻的影响时，配置β-环柠檬醛的初始浓度分别为1，0.5，0.2，0.1和0.01g/L，在不同时间测光能利用率α。1.3分析设备和方法调制叶绿素荧光分析仪(PHYTO-PAM，德国Walz公司)用于测定光能利用率α(即细胞光合活性)，在室温下进行，暗适应时间不少于10min。分光光度计(美国哈希公司，DR/2010)在680nm波长的吸光度可反映铜绿微囊藻的个数，其相关性较好，R2可达0.99以上。高效液相色谱仪(HPLC，型号：LC−2010AHT,，Shimadzu，日本)用于测定微囊藻毒素MC-LR的浓度。色谱柱为BDS−C18反相色谱柱，其尺寸为150mm(长)×4.6mm(内径)×5m(膜厚度)。流动相为甲醇和pH=3的磷酸缓冲溶液，比例为57:43；检测波长为238nm；柱温40℃；分析时间为15min；MC-LR的响应时间为12.5min。2结果与讨论2.1对藻液颜色的影响试验向正常生长的铜绿微囊藻藻液中投加1g/L的不同嗅味物质，观察随着时间的推移藻液颜色的变化情况，结果如图1所示。藻液本身的颜色为绿色(由于含有叶绿素所致)，藻细胞分布均匀，没有悬浮物和沉淀。经过1h后，1号瓶中的藻液变成了蓝色，随着时间的延长，颜色越来越浅，到第8h后，已经变成乳白色，并有悬浮物。而2号瓶的颜色自第8h开始，由原来的绿色逐渐变成了黄绿色。4号瓶和5号瓶自第18h开始，绿色也越来越浅，在第30h后逐渐转变成蓝色，甚至乳白色(5号瓶，92h时)。对于3号瓶，在整个试验过程中，同空白样品一样，颜色没有明显地变化，仍是绿色。藻液的颜色之所以发生变化，主要是由于藻细胞受到破坏后，胞内的藻蓝蛋白，溶解到水中造成的[8]。这与在实际水环境中，蓝藻衰亡时水体颜色变化特征一致。表明水体由绿色变为蓝色与水体中的嗅味物质积累到一定程度有关。Ozaki等[9]曾在研究中提到β-环柠檬醛是唯一引起藻液颜色变化的挥发性物质，但试验的时间仅有7h，无法观测到其他嗅味物质的作用效果。在本研究中，通过对藻液颜色的观察，可以发现嗅味物质会不同程度地引起藻液颜色变化，对铜绿微囊藻细胞的影响从大到小依次是：β-环柠檬醛，β-紫罗兰酮，庚醛，二甲基三硫醚，甲硫醚。由此可见：萜类化合物和脂肪酸对藻细胞的破坏作用较大，而含硫化合物的抑制活性较小。2.2对藻细胞光合活性的影响试验采用吸光度AOD680来反映藻细胞的数量，利用PAM仪器所测得的光能利用效率α来反映细胞的光合活性。图2所示为AOD680随时间的变化。从图2可以看出：在第1h内，β-环柠檬醛作用下的藻液的AOD680降到0.45左右，并保持稳定，说明有些细胞已中南大学学报(自然科