高效芘降解细菌的筛选_鉴定及其基本特性研究_王蕾

第４３卷第６期２０１１年１２月西安建筑科技大学学报（自然科学版）Ｊ．Ｘｉ′ａｎＵｎｉｖ．ｏｆＡｒｃｈ．＆Ｔｅｃｈ．（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．４３Ｎｏ．６Ｄｅｃ．２０１１高效芘降解细菌的筛选、鉴定及其基本特性研究王蕾１，２，聂麦茜２，杨学福３，曹雯２，杨玉珍１，廖慧彬１（１．陕西省环境监测中心站，陕西西安７１００５４；２．西安建筑科技大学环境与市政工程学院，陕西西安７１００５５；３．西安工业大学建筑工程学院，陕西西安７１００３２）摘要：以多环芳烃为唯一碳源梯度驯化，从焦化废水底泥中分离筛选出２株疏水性高效芘降解细菌ＣＹ４和ＨＹ７．通过１６ＳｒＤＮＡ基因序列分析，初步鉴定ＣＹ４为杀鲑气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ），ＨＹ７为施氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）．降解性能试验结果表明，这两株菌可利用底物谱较为广泛，包括水杨酸等多环芳烃转化产物，吲哚等杂化芳烃，多环芳烃和葡萄糖；其中ＣＹ４菌对芘的５ｄ降解率达３５．４０％，ＨＹ７菌对芘的５ｄ降解率达３６．３２％．关键词：芘；降解菌；疏水性；底物谱；降解率中图分类号：Ｘ１３２文献标志码：Ａ文章编号：１００６－７９３０（２０１１）０６－０８５９－０５．＊在多环芳烃（ＰＡＨｓ）的微生物降解研究中，能够合成多环芳烃加氧酶的菌种的分离筛选尤为重要［１］．从遗传机制看，为在污染环境中生存，细菌之间可发生基因水平转移或细菌的染色体内进行基因重排、突变、复制等，以使其能抵抗污染物的毒性，并可利用有机污染物碳源生长［２］．因此，多环芳烃污染环境中存在种类繁多的能代谢多环芳烃的微生物，这为人们直接从污染区样品中获得多环芳烃降解菌提供了依据．迄今已分离出多种降解ＰＡＨｓ的细菌［３］，但遗憾的是这些研究多针对萘、菲等三环以下的低分子量ＰＡＨｓ展开．而芘分子是四环的、分子量较高，且许多致癌多环芳烃分子中含有其结构，因此，高分子量多环芳烃的研究工作中，芘常被用作典型多环芳烃分子［４］．本研究选取焦化废水排水沟底泥为菌源，通过驯化筛选分离出多环芳烃降解菌，研究其基本特性和对芘的降解能力，在此基础上，利用１６ＳｒＤＮＡ片段扩增方法，对２株高效降解菌种属进行鉴定，发现在多环芳烃的降解研究中，国内外对这两株菌鲜见报道，其中一株菌对芘的降解在国内外属首次报道．１材料与方法１．１优良菌源取陕西省富平焦化厂焦化废水排水沟底泥作为菌源．底泥为亮黑色，粘稠呈半流体状，有刺激性气味，且表面有油性物质．１．２主要试剂和主要培养基芘丙酮标准溶液：准确称量０．２５００ｇ芘（分析纯），用５０．０ｍＬ丙酮溶解并定容，芘浓度为５．０ｇ／Ｌ．蒽菲芘混合丙酮溶液：准确称取蒽、菲、芘各０．２５００ｇ，放入同一个棕色容量瓶，用５０．０ｍＬ丙酮溶解定容，其中蒽、菲、芘浓度分别为５．０ｇ／Ｌ，低温保存备用．吲哚、吡啶、喹啉水溶液：无菌条件下，分别将０．１ｇ吲哚、０．１ｍＬ吡啶或喹啉用无菌水溶解，定容至５０．０ｍＬ，其浓度均为２ｇ／Ｌ．磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）参见文献［４］．无机盐培养基（ＭＳ）参见文献［４］，测得此培养基ｐＨ为７．４．多环芳烃菌驯化培养基：在无机盐培养基中加入一定量的吲哚、吡啶、喹啉、蒽菲芘作为唯一碳源．多环芳烃菌筛选分离培养基：在无机盐培养基中加入２％的琼脂，１２１℃灭菌３０ｍｉｎ，在无菌操作下加入蒽菲芘，摇匀，倒成平板备＊收稿日期：２０１１－０３－０１修改稿日期：２０１１－１０－１５基金项目：陕西省教育厅专项项目（０７ＪＫ２９０）作者简介：王蕾（１９８３－），女，陕西商洛人，博士，难降解有机物的微生物处理技术及环境监测数据综合分析．DOI:10.15986/j.1006-7930.2011.06.001用．富集培养基：即牛肉膏蛋白胨培养基（ＮＢ），参见文献［４］．１．３实验方法１．３．１菌源的预处理和菌的驯化方法预处理：从陕西富平焦化厂焦化废水排水沟中取回底泥，在自制反应器中搅拌处理２０ｍｉｎ，再曝气活化２４ｈ．菌的驯化：采用逐步提高碳源浓度的梯度驯化方法，取预处理后的底泥上清液１０ｍＬ加入到４０ｍＬ多环芳烃菌液体驯化培养基中．在３０℃、１６０ｒ／ｍｉｎ生物摇床上好氧震荡培养，培养一个周期（７ｄ）后从中取出１０ｍＬ加入到含有较高浓度驯化碳源的新鲜液体培养基中，进入下一个培养周期，如此持续培养７个周期．驯化碳源浓度梯度见表１．表１多环芳烃降解菌驯化周期的碳源梯度浓度Ｔａｂ．１ＴｈｅｇｒａｄｉｅｎｔｃａｒｂｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｏｒａｃｃｌｉｍａｔｉｎｇａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇＰＡＨｓｓｔｒａｉｎｓＶａｒｉｅｔｙｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓＧｒａｄｉｅｎｔｃａｒｂｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｒｏｍ１ｓｔｔｏ７ｔｈｗｅｅｋｓ／ｍｇ·Ｌ－１１ｓｔ２ｎｄ３ｒｄ４ｔｈ５ｔｈ