焦化废水处理系统中不同培养基分离的细菌种群多样性_陈敏

43卷3期2003年6月微生物学报ActaMicrobiologicaSinicaVol.43JuneNo.32003基金项目:国家高科技研究发展计划项目(SZ-03-01-04);“863计划”项目(2001AA214131)＊通讯作者。Tel:86-21-54743351;Fax:86-21-54743348;E-mail:lpzhao@mail.sjtu.edu.cn作者简介:陈敏(1963-),女,浙江绍兴人,副教授,主要从事环境微生物的研究。收稿日期:2002-08-12,修回日期:2002-10-12焦化废水处理系统中不同培养基分离的细菌种群多样性陈敏1,2赵立平2＊(1杭州师范学院生命科学学院杭州310012)(2上海交通大学生命科学技术学院微生物分子生态学与基因组学实验室上海200240)摘要:以焦化废水处理系统的微生物群落为对象,对3种不同培养基(YPG、LB、WW)分离细菌的能力及分离物的种群多样性组成进行了比较研究。同一悬浮污泥样品在YPG、LB和WW培养基上的活菌计数结果分别为1.6×106CFUmL、7.0×105CFUmL和9.8×105CFUmL。从每种培养基10-4稀释度平板上共分离137株分离物。将所有分离物扩增近全长的16SrD-NA并用限制性内切酶HinfI对PCR产物进行ARDRA(AmplifiedrDNArestrictionanalysis)多态性分析,共得到14种不同的操作分类单元(OperationalTaxonomicUnit,OTU)。其中YPG培养基上的分离物显示了8种不同的OTUs,而WW培养基和LB培养基分离物只分别显示了6种和4种OTUs。YPG-OTU1和WW-OTU6所包含的菌株分别占到总分离物的30%和22.3%,为优势分离物。ERIC-PCR基因组指纹图分析表明,前者的34株分离物共有20种不同的指纹图类型,而后者的25株分离物只有3种。因此,就分离焦化废水处理系统中的细菌及对分离物进行种群多样性的研究而言,YPG培养基比其他两种培养基更合适。关键词:培养基,分离物,种群多样性,ARDRA,ERIC-PCR中图分类号:Q93文献标识码:A文章编号:1006-6179(2003)03-0366-06近年来发展了许多不依赖纯培养的分子生物学的方法来研究未培养或不能培养的微生物[1,2],已经形成一个新兴的学科分支———微生物分子生态学。但另一方面,对纯培养物的生理和遗传功能的研究仍是群落生态学不可缺少的组成部分[3]。因此,建立一类把分离培养技术和分子生态手段相结合的方法,对检测具特定生态功能的细菌种群的多样性、研究微生物与环境之间的相互作用等具重要的意义。Dalmastri等人[4]曾用纯培养的方法从玉米根部分离了大量菌株,然后用ARDRA(AmplifiedribosomalDNArestrictionanaly-sis)的方法从中鉴定出83株菌株属于Burkholderiacepacia,进一步用RAPD指纹图分析技术来分析这些菌株的遗传多样性,发现B.cepacia属于种内变异相当大的一个种。这种基于PCR的技术已成功地应用于对各种不同环境中分离的细菌种群进行遗传多样性的研究上。分批富集培养通常所用的高营养浓度将使低速生长的细菌不能与较高速率生长的细菌相竞争,结果往往是具最高生长速率的一个或少数种群占优势[5]。本文以焦化废水处理系统的微生物群落为研究对象,通过涂平板分离结合分子分类学的手段,评估不同的培养基和培养方法对检测焦化废水中微生物种群多样性的影响,为发展适合生态学研究目DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2003.03.014的的新方法和新思路奠定基础。1材料和方法1.1样品采自上海某焦化厂废水处理系统(A2O法)好氧池的悬浮污泥。1.2培养基与试剂LB培养基:酵母抽提物0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl1%,pH7.0～7.5。YPG培养基:酵母抽提物0.2%,蛋白胨0.1%,葡萄糖0.2%,pH7.0～7.5。WW培养基:取该废水处理厂原废水,经离心去除粗颗粒和过滤除菌后加琼脂1.2%,自然pH。PCR试剂、限制性内切酶等购自Promega公司。1.3细菌的分离和纯化将悬浮污泥样品充分振荡,用磷酸盐缓冲液倍比稀释,制备10-1～10-5的稀释样品。取0.2mL各稀释度样品分别涂布于YPG、LB和WW培养基平板上,每个样品重复3皿。将平板倒置,在20℃恒温培养箱内培养2～4周,每天进行平板菌落计数。选择菌落数在30～100范围的稀释度平板,将所有单菌落分别转接划线在相同培养基平板上,分离纯化。1.4PCR反应模板的简易制备用牙签从平板上挑取单菌落少许,将菌悬于20μL无菌水中,封口膜封口,95℃水浴10min,立即置于冰上,10