活性污泥的ATP检测法

活性污泥活性污泥ATP生物荧光快速检测法生物荧光快速检测法一、一、原理及实验步骤原理及实验步骤1.原理：ATP浓度与微生物浓度间有稳定的对应关系（5×10-16—5×10-15gATP/bacterium）。在有氧条件下，虫光素酶催化D-荧光素和ATP之间发生氧化反应，形成氧化荧光素并发出荧光，其生化反应式如下：ATP＋D-Luciferin＋O2___________AMP＋Oxyluciferin＋ppi＋CO2+Light当反应系统中，虫光素酶和D-荧光素处于过量情况下，荧光的强弱取决于ATP的数量。以检测含细菌的样品为例，细菌细胞越多，ATP含量越高，发出的荧光就越强。在排除样品中非细菌ATP干扰的情况下，通过荧光值就能确定样品中细菌ATP的含量。2.实验步骤详见《ATP荧光法微生物（细菌总数）快速检测系统使用说明书》，针对活性污泥，大致步骤为：1）标准曲线的制定——已知浓度的细菌进行梯度稀释，测定已知浓度细菌对应的荧光值；2)取样——过膜或者梯度稀释；3）ATP提取试剂提取——表面活性剂，破膜；4）与荧光素和荧光素酶试剂作用；5）荧光测定仪测定，出值。3.相关要点说明1）此种方法以往由于荧光素和荧光素酶的价格昂贵难以普及，近年来荧光素酶可以通过重组大肠杆菌产生，价格大幅下降；2）从灵敏度来讲，ATP生物发光法要求样品中细菌浓度不低于1000个/ml；3）通过ATP的测定，可以测出某些化学物质对废水微生物的生化毒性及允许浓度；4）ATP法的优缺点优点缺点1可做及时性测定有时灵敏度达不到要求2测定范围广受游离ATP和体细胞的干扰3可自动化操作受盐分等的干扰4操作简便快速不能做细菌鉴定5可做活性测定5）实验中常见的问题集解决方法问题对策1游离ATP浓度高于细胞内ATP浓度用酶水解游离ATP（三磷酸腺苷双磷酸酶）2样品中细菌数目太少过0.45um的膜截留、浓缩Mg2+Luciferase二、二、实验所需仪器、药品及联系方式实验所需仪器、药品及联系方式1.微量荧光检测仪量程范围0-1010cfu/ml实际检测灵敏度（ATP）5×10-18mol检测时间1秒-99秒自由设定精确误差±5%由仪器生产厂家采用稳定的C14放射源进行定标，校准可检波长300-650nm仪器价格国产一般2-4万元/台；进口一般5万元以上推荐型号：荧光分光光度计-930A；联系方式：0571-86973363,86976021,13666618771，传真：0571-869760212.试剂1）ATP比色/荧光分析检测试剂盒：4000元/100次分析；武汉艾美捷科，电话：02784454412，传真：027-844548762）虫荧光素酶，荧光素：300元/瓶上海宝曼生物科技，电话：13916526570（魏）三、三、参考文献参考文献1.《ATP生物发光法快速测定生乳中微生物总数的研究》（2008）2.《ATP生物发光法在微生物检验上的应用》（1999）3.《利用ATP生物发光法测定西湖水体微生物量》（2006）4.《ATP生物发光法饮用水中细菌总数快速测定方法研究》（2009）5.《ATP测定在活性污泥法中的应用研究》（1999）