酶活测定方法

1已有研究表明，PBDEs可以诱导动物体活性氧的产生，因而可以将抗氧化酶作为PBDEs的生物标记物(张喆,王学锋etal.2013)研究发现，多数海洋发光菌中有SOD酶(PugetandMichelson1974)污染物进入生物体后，可能导致生物体产生一系列生理生化特征变化，因此，测定生物体生理生化指标及酶活性变化有助于揭示毒性作用机制。对于混合物暴露时，氧化应激机制与单一污染物暴露是否相似？联合毒性效应变化与氧化应激机制有何内在关系？是这一部分要关注的主要内容。本研究拟采用扫描电子显微镜（SEM）观察混合暴露后生物体细胞性状的变化；采用Bradford法考察生物体蛋白含量变化情况；用分光光度法测定斜生栅藻暴露于混合物后叶绿素a含量变化情况。超氧化物歧化酶（SOD）的活性采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定；脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量用TBA比色法测定[7,14,26]。为了分析联合毒性机制，我们在测定筛选出的6组加和、协同、拮抗混合物的剂量——效应曲线的同时，设置与剂量——效应曲线浓度系列一致、染毒时间相同的一系列混合体系样品，测定它们的叶绿素a含量、SOD活性、MDA含量变化情况，绘制出剂量——效应——叶绿素a含量、剂量——效应——SOD活性、剂量——效应——MDA含量三维关系图，考察混合体系联合毒性效应变化与生理生化指标变化之间的关系，并与单一化合物的相应结果进行比对，结1、粗酶液的提取、粗酶液的提取(刘霞刘霞,赵静赵静etal.2012)方法1(刘霞刘霞,赵静赵静etal.2012)：参照孙利芹等［19］的方法，量取待测藻液50mL，4000r/min下离心15min，收集藻细胞沉淀物，加入适量0．05mol/L磷酸缓冲液，置于冰水浴中超声波破碎藻细胞，超声功率为150W，超声时间20min，镜检无完整细胞后，4℃下离心15min，取上清液用于酶活性分析。方法2：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入2ml50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。2、超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法））活性测定（氮蓝四唑光化还原法）2.1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。（2）14.5mM甲硫氨酸Met溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。（3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000lux光照下反应20min；2同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μlPBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。（5）酶活性计算酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。SOD总活性＝/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。酶活性计算酶活性计算方法方法2(刘霞刘霞,赵静赵静etal.2012):一个酶活力单位(U)定义为能引起反应初速度(指不加酶提取