伤寒沙门氏菌SOD的提取及抗原性研究_徐军发

第21卷第6期1996年21月生物化学杂志Vol.12.No.6ChinseeBioehemiealJournalDee.,1996伤寒沙门氏菌SOD的提取及抗原性研究徐军发①凌天翼唐俊杰(贵阳医学院微生物学教研室,贵阳50()()4)摘要经硫酸按分级沉淀,DEAE纤维素柱层析提取了伤寒沙门氏菌SOD.提取后酶的比活性为3270U/mg.经聚丙烯酸胺凝胶电泳,蛋白质染色及晦活性染色显示提取的SOD达到了电泳纯.酶活性染色法和原子吸收分光光度法测定结果表明提取的SOD为Fe一SOD.双向晾脂扩散试验结果显示抗伤寒沙门氏菌Fe一SOD血清与牛红细胞SOD不形成沉健线,提示伤寒沙门氏菌Fe一SOD与牛红细胞SOD无交又反应.杭体对酶活性抑制试验结果显示杭Fe一SOD血清可抑制伤寒沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌的eF-SOD和Fe/Mn一SOD活性,对Mn一(S)D活性无抑制作用,说明伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的SOD之间有共同杭原,也提示SOD的辅基似乎决定了其杭原特异性.关键词:SOD,伤寒沙门氏菌,提取,杭原性超氧化物歧化酶(SuePorxldeidsmutase,(S)D)是需氧微生物在有氧环境中生存的必要条件.目前发现细菌的s0D主要是以Fe或Mn作为辅基〔`二,但也有些细胞的s()D含cu和z分“].细菌的soD与其毒性有关,如星形奴卡氏菌[’]、结核分枝杆菌[`〕、福氏志贺氏菌15〕等.我们提取了野生型伤寒沙门氏菌的SOD并对其抗原性进行了研究.1材料和方法1.1材料伤寒沙门氏菌野生株(S。zmo;,ella,劝hiwildstrain,Stw),简称Stwl,抗原类型为09,Vi,Hd,由贵阳医学院韦树丰老师赠送.大肠杆菌ATCcso99株和鼠伤寒沙门氏菌(aSzmonelalytPihmu:iu。,stm)毒力株(抗原类型为()4,5,12,Hi,1,2)为本教研室保存菌株.牛红细胞SOD系Sigma公司产品,比活性为3800U/mg.DEAE纤维素(DE一52,Whatman).丙烯酞胺和甲叉丙烯酸胺均为lFuka公司产品.其余试剂均为国产分析纯.1.2StwlSOD提取将细菌接种于LB液体培养基,37℃120:/min摇床培养24h,400:/min离心收集细菌,并以0.05mol/LpH7.8含10一4mol/LEDTA的磷酸钾缓冲液(简写为EDTA一P)B洗3次,且悬于相同缓冲液中,按文献仁6,7〕提取SOD.即先将细菌用超声波破碎制备无细胞裂解物,再用5%和80%饱和度的硫酸按分级沉淀,取80%硫酸按盐析的沉淀加入少量20mmol/L①硕士研究生,现工作于广东医学院检验系收稿日期:1995一10一04,修回日期:1996一03一11720TDEA一Pl时容解,并对此缓冲液透析至外液中无NH+4,冷风吹浓缩.通过预先用20mmol/LEDTA一PB平衡的DEAE层析柱,依次用不同浓度的EDTA一P(B20mmol/L100ml,30mmol/L100ml,30一100mmol/L200ml)洗脱.收集活性部分,浓缩后进行第二次DEAE柱层析,层析柱先用10mmol/LEDTA一PB平衡,并用10一100mol/LEDTA一PB180ml洗脱.收集活性部分,浓缩后放一30℃保存.1·3SOD活性和蛋白含量测定soD活性测定用硝基四氮哩蓝还原法〔8,9」,蛋白含量按分光光度法[`。〕测定.1·4凝胶电泳分析将提取的sOD进行聚丙烯酞胺凝胶圆盘电泳,并分别用考马斯蓝R一250和NBT活性染色[“〕.1·5SOD辅基测定用酶活性抑制法[`〕检测提取的s0D对不同抑制物的敏感性和原子吸收分光光度法检测提取的SOD中Fe、Mn两种元素的含量以确定SOD的辅基.1.6抗s0D血清制备将提取的SOD免疫家兔制备兔抗SOD血清,并用lE洲ISA法检测抗血清效价,用免疫电泳法检测抗血清纯度.1.7双向琼脂扩散试验用提取的tSw1SOD和牛红细胞SOD与兔抗SOD血清作双向琼脂扩散试验.1.8抗血清对PAGE后s0D活性的抑制作用取tSwl、tSm和大肠杆菌无细胞溶解物及提取的tSw1SOD作PAGE.电泳后的凝胶浸入5mll:50的抗血清中,37℃h3,取出凝胶作SOD活性染色.2结果和讨论2·1SOD提取结果两次DEAE柱层析结果见iFg.1和iFg.2.提取过程中酶的总活性和比活性变化见Table1.最后得到的SOD比活性为3270u/mg,与其他作者报道的结果相近〔4,7〕.Table1Pur一f一eationofSalmonellaryph1s()DProtelnTotalFraetzoneoneentrat一on\olume/mlProtejnSpeelf一cactlv一tyToralaCtlVltVFoldsofPur一