厌氧生境体系中产氢产乙酸细菌的FISH定量解析_李艳娜

47卷6期2007年12月4日微生物学报ActaMicrobiologicaSinica47(6):1038～10434December2007基金项目:国家自然科学基金(50508014);国家“863计划”(2006AA06Z315)＊通讯作者。Tel:86-510-85918310;Fax:86-510-85918309;E-mail:liuhe@jiangnan.edu.cn作者简介:李艳娜(1983-),女,河南濮阳人,硕士研究生,主要从事废物资源化和环境微生物研究。E-mail:liyanna-163@163.com收稿日期:2007-07-03;接受日期:2007-08-03;修回日期:2007-09-07厌氧生境体系中产氢产乙酸细菌的FISH定量解析李艳娜1,许科伟1,堵国成1,2,陈坚1,2,刘和1＊(江南大学生物工程学院1环境生物技术研究室2工业生物技术教育部重点实验室无锡214122)摘要:产氢产乙酸细菌是一类在有机物厌氧降解过程中起重要作用的细菌。以基于16SrRNA序列设计的特异性寡核苷酸探针为基础,优化FISH实验条件,确定该技术检测产氢产乙酸细菌的实验条件为样品固定19h、乙醇脱水5min,杂交缓冲液中甲酰胺浓度55%。运用建立的FISH技术检测了几种厌氧消化体系中产氢产乙酸细菌的数量,并与用传统MPN方法的结果进行了比较。结果表明,产氢产乙酸细菌分布广泛,废水处理UASB反应器和动物消化道,特别是反刍动物瘤胃中的产氢产乙酸细菌数量较高,其丰度分别为1.70×109cellsmL样品,6.50×108cellsmL样品。湖底沉积物中产氢产乙酸细菌数量较少,仅占整个微生物群落的0.4%,含量为1.20×108cellsmL样品。关键词:产氢产乙酸细菌;荧光原位杂交;寡核苷酸探针;厌氧体系中图分类号:Q938,Q935文献标识码:A文章编号:0001-6209(2007)06-1038-06产氢产乙酸细菌在厌氧消化过程中占有重要位置,使水解发酵细菌水解糖、蛋白质和脂类所产生的代谢中间产物,如丙酸、丁酸等,转化为产CH4的前体———乙酸、甲酸、H2和CO2等。认识和了解产氢产乙酸细菌的形态、组成、分布和丰度等特性对于研究有机物的生物降解和生物转化过程中的微生物学机理等十分重要。Bryant等人在1967年发现并分离纯化出了最早的产氢产乙酸菌株[1],此后,国内外对产氢产乙酸细菌的研究一直不断[2～4]。但是至今,产氢产乙酸细菌的研究仍主要停留在传统分离培养方面,特别是计数方面,主要依赖以纯培养技术为基础的最大或然数方法(MostProbableNumber,MPN)[5～7]。产氢产乙酸细菌是一类严格厌氧的真细菌,生长周期长,而且大部分产氢产乙酸细菌都是互营细菌,即其生长和代谢完全依赖于产甲烷细菌等其他微生物将代谢产物如H2的转移和去除。因此,对产氢产乙酸细菌进行分离培养的研究时,要求极高的操作条件,耗时费力。随着现代分子生物技术的发展,不依靠纯培养的微生物群落结构的分析方法已得到广泛发展和应用,如荧光原位杂交技术(FluorescenceInSituHybridization,FISH),这些方法能够更加精确地揭示微生物种类和遗传的多样性等各方面的性质。目前,通过分子生物技术对产氢产乙酸细菌的研究极少,只有国外一些研究借助了膜杂交等分子生物学方法对其进行过简单的调查分析,国内几乎还没有这方面的研究[8～10]。本文以厌氧消化体系中产氢产乙酸细菌为研究对象,避免传统分离培养技术,应用现代分子生物学技术,建立并优化了检测产氢产乙酸细菌的荧光原位杂交技术,对几种不同生境中的产氢产乙酸细菌进行定量监测,其结果为了解产氢产乙酸细菌在某些厌氧生境中的分布和功能具有实际指导意义。1材料和方法1.1材料1.1.1样品采集:在无锡地区6个地点进行了采集取样,包括(1)无锡某公司UASB反应器中污泥;(2)太湖底泥;(3)城市下水道污泥;(4)无锡DSM柠檬酸厂IC反应器污泥;(5)无锡奶牛场牛粪;(6)无锡城北污水处理厂消化污泥。采集的环境样品立即进行预处理。1.1.2主要试剂和仪器:食丁酸盐产氢产乙酸细菌探针(S-F-Synm-0700-a-R-23)和食丙酸盐产氢产乙酸细菌探针(S-S-S.wol-0223-a-R-19、S-S-MPOB-0222-a-R-19),其修饰合成均由上海生物工程有限公司完成;荧光染料DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)购自上海捷瑞科技有限公司。荧光显微镜(DXM1200C)为Nikon公司产品。1.2样品预处理一定体积的环境样品用磷酸缓冲液1ⅸPBS清DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2007.06.008洗2～3次后,与3倍体积的固定剂