3种石油烃降解菌对石油烃的降解效果及其细胞表面疏水性

化合物（ＢＡＴＨ）法，广泛应用于测量细胞表面疏水性。其原理是细胞表面疏水端能与疏水性强的有机物如正己烷、二甲苯、十六烷、柴油或原油等结合进入有机相，通过测定水相中剩余的细胞数，对比对照组（不添加有机相）和实验组，得出细胞表面疏水性。已有的研究大都采用石油污染土壤中的土著菌作为菌源，然后经过反复驯化，分离出不同种类的高效降解菌。据文献［７～８］介绍，石油烃降解菌主要有无色杆菌属（犃犮犺狉狅犿狅犫犪犮狋犲狉）、不动杆菌属（犃犮犻狀犲狋狅犫犪犮狋犲狉）、产碱杆菌属（犃犾犮犪犾犻犵犲狀犲狊）、芽孢杆菌属（犅犪犮犻犾犾狌狊）、假单胞菌属（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊）及微球菌属（犕犻狉狅犮狅犮犮狌狊）等。本研究选取３种石油烃降解菌：假单胞菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊ｓｐ．，ＤＳ１）、铜绿色假单胞菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊犪犲狉狌犵犻狀狅狊犪，ＤＳ２）和无色杆菌（犃犮犺狉狅犿狅犫犪犮狋犲狉ｓｐ．，ＤＳ３），研究其对石油烃降解效果的同时，采用黏附性测试和盐析聚集测试对其细胞表面疏水性进行了研究，为石油烃的微生物修复提供理论指导。１材料与仪器设备１．１实验材料１．１．１主要实验试剂Ｋ２ＨＰＯ４，ＮａＨ２ＰＯ４，（ＮＨ４）２ＳＯ４，ＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ，ＮａＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ，ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ，ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ，ＭｎＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ，乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ），二甲苯，无水硫酸钠，正己烷，０＃柴油（经气相色谱（ＧＣ）测试分析，０＃柴油中石油烃的成分和含量与研究场地污染土壤中石油烃相似），９５％（质量分数）乙醇，草酸铵，碘化钾，结晶紫，碘，番红。１．１．２实验菌株实验所采用的石油烃降解菌为实验室保存菌株，是对松原油田石油污染土壤（表层０～３０ｃｍ）进行采样，然后经富集筛选分离培养后所得，共３株菌，分别命名为ＤＳ１、ＤＳ２和ＤＳ３。经鉴定，３种菌分别为假单胞菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊ｓｐ．）、铜绿色假单胞菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊犪犲狉狌犵犻狀狅狊犪）和无色杆菌（犃犮犺狉狅犿狅犫犪犮狋犲狉ｓｐ．）。１．２主要仪器设备ＧＣ２０１４气相色谱仪（日本岛津）、ＨＹＧＡ全温振荡器、手提式压力蒸汽灭菌器、ＬＤ４２Ａ医用离心机、ＳＰＤＪ系列垂直净化工作台、电子显微镜、分光光度计、ｐＨ计、ＪＭＳ６７００Ｆ场发射扫描仪等。１．３培养基无机盐液体培养基（单位：ｍｇ／Ｌ）：（ＮＨ４）２ＳＯ４２０００，Ｋ２ＨＰＯ４１５５０，ＮａＨ２ＰＯ４８５０，ＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ１００，ＥＤＴＡ１０，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ５．０，ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ２．０，ＭｎＣｌ２·２Ｈ２Ｏ１．０，ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ１．０，ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ０．４，ＮａＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ０．２，ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ０．２。ＬＢ培养基：蛋白胨１０ｇ，酵母膏５ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ７．２。磷酸盐缓冲液（０．２ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０）：由３９ｍＬ０．２ｍｏｌ／ＬＮａＨ２ＰＯ４溶液与６１ｍＬ０．２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ溶液混匀。石油烃降解菌培养液：１００ｍＬ无机盐液体培养基中加入２００ｍｇ０＃柴油。１．４样品总石油烃（简称ＴＰＨ）测试分析方法样品ＴＰＨ采用气相色谱仪进行测定。注入口ＳＰＬ１注入方式：切片；温度：２８０℃；载气：氮气／空气；流量控制方式：压力；压力：５９．５ｋＰａ；总流量：３７．７０ｍＬ／ｍｉｎ。柱箱流量：１．６５ｍＬ／ｍｉｎ；线速度：３０．９ｃｍ／ｓ；清洗流量：３．００ｍＬ／ｍｉｎ；分流比：２０．０；高压力注入：关闭；载气保存：关闭；分流器定位：关闭；柱箱初始温度：８０℃；平衡时间：３．０ｍｉｎ；总程序时间：３１．５ｍｉｎ。柱箱名：Ｒｔｘ１；序列号：１０１２４；薄膜厚度：０．２５ｍｍ；柱箱长度：３０．０ｍ；内径：０．３２ｍｍ；柱箱最大温度：３３０℃。检测器通道１（ＤＦＩＤ１）温度：２９０℃；信号采集：是；采样速率：４０ｍ／ｓ；停止时间：３１．０ｍｉｎ；延迟时间：０ｍｉｎ；极性：＋；进样体积：１．０μＬ。２实验方法２．１菌体形态测定取３种菌株用ＬＢ培养基培养至对数期，分别取１０ｍＬ培养液于离心管中，于４０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，底物用磷酸盐缓冲液清洗２次后，将菌体悬浮于磷酸盐缓冲液中。各菌株采用ＪＭＳ６７００Ｆ场发射扫描仪进行电子显微镜扫描成像，观察菌株大小及形态。２．２石油烃降解效果测定１９个１００ｍＬ的锥形瓶中分别加入５０ｍＬ的无机盐液体培养基、１００ｍｇ０＃柴油。其中１个样品不加菌作空白对照，其余１８个样品每６个分别加入５ｍＬ同种石油烃降解菌（溶液在６００ｎｍ波长处的吸光度（ＯＤ６００）约为０．６），于１２０ｒ／ｍｉｎ、３０℃下振荡培养６ｄ