豆腐废水UASB反应器中的原核生物多样性及主要功能菌群_张春杨

44卷2期2004年4月微生物学报ActaMicrobiologicaSinicaVol.44AprilNo.22004基金项目:国家杰出青年基金(30025001);国家“863计划”(2001AA227131)＊通讯作者。TelFax:86-10-62558320;E-mail:dongxz@sun.im.ac.cn作者简介:张春杨(1975-),女,山东安丘人,博士研究生,主要从事微生物资源和系统发育研究。E-mail:zcy530336@sina.com收稿日期:2003-06-17,修回日期:2003-09-29豆腐废水UASB反应器中的原核生物多样性及主要功能菌群张春杨刘晓黎东秀珠＊(中国科学院微生物研究所北京100080)摘要:通过构建16SrRNA基因文库,对豆腐废水UASB反应器中颗粒污泥的原核生物多样性进行了分析,并用MPN法对颗粒污泥中的互养产乙酸细菌和产甲烷菌进行了活菌数量测定。结果表明,33%的16SrRNA基因序列属于产甲烷菌,氢和乙酸盐营养型的产甲烷菌在颗粒污泥中数量最多,分别为1.1×109个mL和4.5×108个mL。低GC革兰氏阳性菌和δ-变形菌纲分支的细菌也是颗粒污泥中的主要菌群,它们的16SrRNA序列分别占22%和9%,其中互养产乙酸细菌在颗粒污泥中的数量可达4.5×107个ml。绿色非硫细菌是另一类丰度很高的细菌,其16SrRNA序列占文库的12%。对各类微生物在颗粒污泥中可能的作用进行了讨论。通过研究不仅了解了特定环境中的微生物组成,还为从中分离特异类群的微生物提供了指导。关键词:UASB颗粒污泥,系统发育多样性,互养产乙酸细菌,产甲烷菌中图分类号:Q939文献标识码:A文章编号:0001-6209(2004)02-0141-07在无光、无氧、无SO42-、NO3-、Fe3+等电子受体的环境中,复杂的有机物被彻底分解为甲烷和二氧化碳主要由水解发酵菌(Hydrolyzingandfermentingbacteria),互养产乙酸细菌(Syntrophicacetogens),和产甲烷菌(Methanogens)协同完成[1]。其中76%的有机物先被降解为中间产物(如短链脂肪酸、一元醇等),由于这些物质的降解是热力学上的吸能反应,因而必须由其降解菌(互养产乙酸细菌)在耗氢菌(如产甲烷菌)的协助下才能完成。研究互养产乙酸细菌和产甲烷菌的资源以及它们的生理代谢特征,对了解有机物的厌氧降解、清除环境污染以及能源再生有重要意义。研究发现,海洋、湖泊、河流的水底沉积物,稻田污泥,反刍动物的消化系统及各类工业和农业废水的UASB(Up-flowAnaerobicSludgeBlanket)反应器是互养细菌及产甲烷菌的主要生境,其中UASB反应器的颗粒污泥(Granularsludge)中相关菌群最丰富,因为这些功能菌群形成了聚集体,有利于细胞间物质的传递[2]。豆腐废水是一类COD含量较高、蛋白质丰富的有机废水[3]。北京“王致和豆制品厂”废水UASB反应器是运行了十几年的产甲烷反应器,它可将豆腐废水COD从进水的11.5kgm3降到出水的0.3kgm3,去除率达97.4%,并且产生大量的甲烷气体常年供给附近居民作燃气。本研究采用非培养手段构建了此UASB反应器颗粒污泥的16SrRNA基因文库,普查其原核生物多样性,并采用培养手段对其中的互养产乙酸细菌和产甲烷菌进行了计数,为下一步分离此类菌群打下了基础。1材料和方法1.1采样从“王致和豆制品厂”废水UASB反应器中采集活性颗粒污泥,分装于厌氧管以用于之后的DNA提取和分离培养。1.2试剂和培养基1.2.1试剂:TaqDNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司;T4DNA连接酶、pUCm-T载体来自MBI-Fermentas。1.2.2培养基:在预还原的基础培养基[4]中分别加入20mmolL丙酸钠,20mmolL丁酸钠或10mmolL苯甲酸钠分别培养降解丙酸、丁酸或苯甲酸的互养细菌;加入20mmolL乙酸钠或H2CO2(80∶20)混合气体(1.3×105Pa)分别培养乙酸型或氢营养型的产DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2004.02.003甲烷菌。预还原的培养基分装于25mL厌氧螺口管(每管装5mL)中,加盖丁酰基橡胶塞和螺盖。除氢营养型甲烷菌外,其他菌的培养均用1.01×105Pa的N2CO2(80∶20)作为气相。1.3颗粒污泥16SrRNA基因文库的构建和分析1.3.1DNA提取:颗粒污泥中总DNA的提取采用传统的酚氯仿抽提法[5]并稍做改进,即在DNA提取前,将冷冻的颗粒先在室温下缓慢融化,然后用磷酸盐缓冲液(10mmolL,pH7.2)轻轻漂洗。取30到50个直径为0.3mm～0.5mm的颗粒,在