好氧反硝化菌的物理诱变法育种研究

第27卷第3期2009年5月北京工商大学学报(自然科学版)JournalofBeijingTechnologyandBusinessUniversity(NaturalScienceEdition)Vol127No13May2009文章编号:167121513(2009)0320005204好氧反硝化菌的物理诱变法育种研究李永智,汪苹,王磊(北京工商大学化学与环境工程学院,北京100048)摘要:以实验室SBR反应器分离出的好氧反硝化菌(WXZ29)为原始菌株,分别用微波和紫外线诱变.通过反硝化性能测定筛选得到的正突变体WXZ2928号,96h后的TIN去除率达到67120%,比出发菌株WXZ29号菌提高了7107%,NO-32N去除率在24h达到100%;WXZ2928号突变体的最大亚硝基氮还原速率达到52189mgNO-22N·L-1·d-1,比WXZ29号菌株高6190mgNO-22N·L-1·d-1.结果表明:WXZ2928号突变体具有更好的亚硝基氮还原酶的活性,并且比出发菌株有更好的生长适应性.关键词:好氧反硝化菌;微波诱变;紫外线诱变中图分类号:X172;TS06文献标识码:A收稿日期:2009-02-20基金项目:国家“十一五”科技支撑计划项目(2007BAK36B07).作者简介:李永智(1983—),男,湖南邵阳人,硕士研究生,研究方向为废水生物脱氮;汪苹(1953—),女,上海人,教授,主要从事水处理研究.通讯作者.味精发酵、皮革制造和酒精酿造等工业的废水是一种高COD、高氨氮的有机废水.这类废水排放量大、污染重,一般的污水处理工艺虽能使其有机碳含量降低,但对其氨氮的去除效果较差,出水氨氮浓度仍很高[1],因而,这类废水成为水体污染尤其是氮污染的重要工业污染源之一.高浓度的有机污水对人类健康和水生态环境带来了严重的危害和潜在的威胁,对其进行有效的脱氮处理,以减轻地表水环境的氨氮污染程度具有重要的意义[2].传统水处理理论认为,氨氮的去除是通过硝化和反硝化两个相互独立的过程实现的.近年来,国内外有不少试验和报道证明,硝化反应和反硝化反应可以在同一操作条件下与同一反应器内进行,称为同步硝化反硝化现象(SimultaneousNitrificationandDenitrifica2tion,SND).好氧反硝化菌和异养硝化菌等[3-4]的发现以及好氧反硝化、异养硝化、自养反硝化等概念的提出,也奠定了同步硝化反硝化生物脱氮新技术的理论基础.本实验室已经成功进行十余株好氧反硝化菌的分离、富集、筛选以及反硝化性能测定和鉴别.但这些菌株的反硝化性能参差不齐,虽然部分菌株对硝基氮的还原率很高,但对亚硝基氮的还原性不好,导致亚硝基氮的积累,或是亚硝基氮的还原率很高,但硝基氮的还原性能不好,总之,其结果均导致总氮的去除率不高.本研究旨在用物理方法,对已有的好氧反硝化菌进行诱变和优化育种,使原始菌株的硝酸还原酶、亚硝酸还原酶的酶活性得到激发、抑制或改变,以达到提高菌株的反硝化性能和生长适应性的目的,希望为诱变育种研究提供微生物学依据,并能为削减环境中有害含氮化合物提供理论依据.1材料与方法111菌源WXZ29号菌株,经PCR扩增、16SrDNA测序结合同源性分析鉴别为tsuruhatensis戴尔福特菌(实验室SBR反应器中分离菌株).112培养基1)液体培养基(LB)KNO3110g/L;KH2PO4110g/L;FeCl2·6H2O015g/L;CaCl2·7H2O012g/L;MgSO4·7H2O110g/L;碳源(柠檬酸三钠)612g/L.2)反硝化培养基(DM)KNO301722g/L;5KH2PO41g/L;MgSO4·7H2O1g/L;碳源(柠檬酸三钠)3106g/L.3)LB琼脂营养培养基NaCl10g/L;琼脂粉20g/L;蛋白胨10g/L;酵母浸粉5g/L.4)BTB琼脂营养培养基KNO3110g/L;KH2PO4110g/L;FeCl2·6H2O015g/L;CaCl2·2H2O012g/L;MgSO4·7H2O110g/L;琥珀酸钠815g/L;溴百里酚蓝(BTB)1mL(取011g溴百里酚蓝溶于10mL酒精).113分析方法[5]NO-22N:采用N2(12萘基)2乙二胺光度法;NO-32N:采用紫外分光光度法;菌体生长吸光度(OD600):采用吸光度法,用721可见分光光度计在光密度为600nm处测定吸光度值;CODCr:采用美国HACH快速测定仪114诱变实验1)菌体的培养用接种针从斜面取出发菌株1环,将其接入装有100mL富集培养基(LB液体培养基)的250mL的锥形瓶中,在30℃下恒温摇床培养12h,使菌体处于对数增长期.2)菌悬液的制备将玻珠瓶中加入生理盐水(45g营养琼脂/L)灭菌,将灭菌后