活性污泥高质量RNA快速提取方法研究

活性污泥高质量RNA快速提取方法研究金敏,赵祖国,邱志刚,王景峰,陈照立,谌志强,李超,王新为,董彦,李君文3(军事医学科学院卫生学环境医学研究所环境卫生与卫生工程研究室,天津300050)摘要:通过比较RNA产量、纯度、降解程度、特定基因的扩增能力、微生物多样性等评价指标,考察和探讨了5种不同RNA提取方法对活性污泥总RNA提取效果的影响并最终建立了一种快速、有效的活性污泥RNA提取方法,即在TENP和PBS洗涤沉淀污泥的基础上,分别采用溶菌酶和TRIzol裂解活性污泥细菌、氯仿去除细菌裂解液中的蛋白和大部分DNA、异丙醇沉淀核酸和DNaseI水解残留DNA后,最后进一步用离心柱纯化RNA.结果表明,这种方法可以有效提取高质量的菌群RNA,不仅提取的RNA总量多(每g污泥可提取16916μgRNA)、纯度高、降解程度低、完整性好、具有丰富的生物多样性,而且可同时进行16SrRNA和amoA基因的RT2PCR扩增反应;与其它方法相比,性价比高,具有明显的优越性,适用于活性污泥RNA的大量提取,同时,T2RFLP结果证明RNA提取方法对分析样品的微生物种类和丰度分析结果影响较大,不同的RNA提取方法所获得的微生物群落基因多样性及其种类、丰度均不同.本研究建立了一种快速、有效的高质量RNA提取方法,将在监测活性污泥菌群动态变化、菌群代谢功能学、微生物群落芯片等研究上具有重要意义.关键词:活性污泥;RNA;菌群;提取;T2RFLP中图分类号:X172文献标识码:A文章编号:025023301(2010)0120260206收稿日期:2009203202;修订日期:2009205205基金项目:国家自然科学基金项目(30771779)作者简介:金敏(1977～),女,博士,副研究员,主要研究方向为环境微生物,E2mail:jinminzh@1261com3通讯联系人,E2mail:junwen9999@hotmail.comRapidMethodtoExtractHigh2QualityRNAfromActivatedSludgeJINMin,ZHAOZu2guo,QIUZhi2gang,WANGJing2feng,CHENZhao2li,SHENZhi2qiang,LIChao,WANGXin2wei,DONGYan,LIJun2wen(DepartmentofEnvironmentalHealthandEngineering,InstituteofHygieneandEnvironmentalMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Tianjin300050,China)Abstract:AneffectiveandfastRNAisolationmethodofactivatedsludgewasestablishedandfivedifferentmethodswerecomparedbasedonRNAyield,purity,integrity,RT2PCRamplificationof16SrRNAgenesandsubsequentterminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism(T2RFLP)analysis.Thatis,theprecipitatedactivatedsludgewaswashedwithTENPandPBSbuffer,followedbyusinglysozymeandTRIzoltodirectlysisofmicrobialcells,chloroformtoremoveproteinandmostoftheDNAfrombacteriallysate,isopropanoltoprecipitatenucleicacidandDNaseItohydrolyzeresidualDNA.TofurtherpurifyRNA,RNApurifyingcolumnwasutilized.Theresultsdemonstratedthattheextractionmethod,withtheaidofTRIzolandRNApurificationkit,caneffectivelyextracthigh2qualityRNA.Itnotonlymeanslowdegradabilityandhighquantity,purityanddiversity,butalsothegenesof16SrRNAandamoAcanbeamplifiedbyRT2PCR.Comparedwithothermethods,itshowedgreatadvantageoflowcostandhighefficiencyand