间接SPA菌体吸附法快速检测单纯疱疹病毒

168中国公共卫生6(3),1987间接SPA菌体吸附法快速检测单纯疙疹病毒中国人民解放军总医院病毒室谷志远宋海静谈代明王敏提要木文联合运用玻片细胞培养板分离病毒和间接SPA菌体吸附法检测感染细胞表面HSV抗原,鉴定分离的病毒。本法快速、简便,可于细胞病变出现前检出感染细胞表面HSv抗原,获很病原诊断。其敏感性与间接免疫荧光法一致。关健词单纯疙疹病毒间接SPA菌体吸附法玻片细胞培养板单纯疤疹病毒(HSv)是引起人类常见病、多发病的重要病原体之一,且和宫颈癌发生有关。该病毒又是已有药物可以控制的少数病毒之一。因此只要对HSv感染尽快作出准确诊断,就可在临床获得良好疗效。为改进HSv感染的病原诊断,我们应用玻片微量细胞培养板分离病毒,继用间接SPA菌体吸附法检测感染细胞HSV抗原,鉴定分离的病毒,可以快速、简便地获得结果。材料和方法1.细胞及营养液乳地鼠肾细胞BHK一21细胞(13克隆株)用于实验研究。其营养液为每10ml中含0.5%水解乳白蛋白的Hank,s液loml,Eagle,s液soml,小牛血清10ml,及抗生素等。人胚肺二倍体细胞ZBS株用于临床标本分离病毒,此细胞及其营养液均系北京生物制品研究所提供。2.病毒采用Hsv一ISM44、HSV一ZSav株(购自北京药品生物制品检定所)。3.抗Hsv兔免疫血清系本室用上述病毒抗原,按马升阳等`”方法免疫家兔制备,中和抗体滴度1:1024,用前以培养病毒的正常细胞吸附处理,室温下作用3小时,离心去除细胞,4℃下保存备用。4.葡萄球菌A蛋白菌体s(PA)系上海生物制品研究所生产的菌体试剂,为10%(w/V)悬液。5.间接免疫荧光法按常规方法进行。6.临床标本采集39份拟诊HSV感染标本,以消毒棉拭子擦拭患部,洗于上述细胞培养液中。如未立即培养分离,置一80℃保存。7.玻片微量细胞培养板分离病毒及间接sPA菌体吸附法(z)方法采用美国Milesseient迁ie生产的Lab一Teks孔玻片微量细胞培养板(简称玻片板)培养分离病毒,如图1、2所示。每个培养室接种约3万细胞,待形成细胞单层滴加0.15ml待检标本,37oC吸附2小时,换维持液,置37℃5%CO:湿润条件下孵育,逐日观察细胞病变(cPE)。待出现cPE,吸出培养室内培养液,由玻片板上取下培养室,随后将这载有感染细胞的玻片用1%戊二醛室温下固定15分钟,水洗风干。滴加适当工作浓度的抗HSV一1或抗HSV一2兔血清,37℃湿盒中温育30分钟,经缓慢流水冲洗10分钟,蒸馏水漂洗、风干。再滴加1%SPA菌体悬液,同上法温育、洗涤。用0.01%结晶紫染液染色10秒钟,水洗风干。普通光学显微镜下观察结果。在每张玻片板上设有正常细胞对照。(2)菌体吸附反应的判断镜检可见Hsv感染细胞被密集的紫红色菌体呈串珠样环状包绕,即菌体吸附阳性反应。未被感染细胞或正常对照细胞有很少量散在菌体吸着,但无菌体环状包绕,即阴性反应,见图3、4。结果一、间接SPA菌体吸附法的特异性、敏感169..一~~.~,...叫,~.,目,~----一.-~`..~..户...-一,.,一...J,~-一-,~.~...一一一一--.~.叫,一.一~一~---一一月一.,,.目户.`.`一~~~,~.目`~.,.一~.一-一.~.一一一.一一电..`.~`...~~~~--一一、.一-~~一,~~~~~~叫~,一,...,..一性正常兔血清与HSV感染细胞作用,或正常细胞与抗HsV兔血清作用,再与sPA菌体作用,呈菌体吸附阴性反应。巨细胞病毒(AD一169株)感染的人胚肺二倍体细胞、乙型脑炎病毒及风疹病毒感染的BHK一21细胞与抗HSV一1兔血清作用,菌体吸附试验也呈阴性反应,未见与HSV产生交叉反应。HSV一1与Hsv一2之间有菌体吸附交叉反应。用10“TCID。。HSV一1感染BHK一21细胞,于感染后每隔4小时以CPE、间接SPA菌体吸附法及间接免疫荧光法平行检测感染细胞、感染后28小时出现CPE。菌体吸附法和免疫荧光法于感染后12小时出现阳性反应,随培养时间的延长反应增强,感染后4、8小时及正常对照细胞呈阴性反应。二、影响实验的因素抗HSv兔血清不同工作浓度比较试验结果表明,需选择最适工作浓度。浓度过高,镜检时视野中背景菌体较多,易出现假吸附反应。非特异性反应随免疫血清稀释度增高而减少。经预备试验确定抗HSv兔血清的最适工作浓度为1:80。当稀释度为1:320时还可见较明显菌体吸附反应。采用1%菌体浓度效果满意,菌体吸附反应显著,非特异吸着菌体少。SPA菌体与抗HSV免疫血清结合的感染细胞作用15分钟,即产生较明显的吸附反应,30分钟效果显著,60分钟与30分钟无明显差别。结晶紫染色使菌体吸附试验结果的判断明晰可辨。其配方系细菌学革兰氏染色法中的结晶紫染液