结晶紫分光光度法测定Fenton反应产生的羟自由基

第24卷第2期2005年6月武�汉�工�业�学�院�学�报Journal�of�Wuhan�Polytechnic�UniversityVol�24No�2Jun�2005��收稿日期:2004-11-02作者简介:刘骏(1976-),男,江苏省南通市人,实验师。文章编号:1009-4881(2005)02-0053-03结晶紫分光光度法测定Fenton反应产生的羟自由基刘�骏(华中科技大学水电与数字化工程学院,湖北武汉430074)摘�要:建立一种以结晶紫作显色剂,用分光光度法测定Fenton反应产生的�OH的新方法。在pH4�0条件下,Fenton反应所产生的羟自由基与结晶紫作用后使吸光度(A)降低,在580nm处用分光光度计测定其A值变化,可间接测定羟自由基的生产量。通过对测定条件的研究,得到最佳实验条件。结晶紫光度法稳定性好,可作为一种简便的筛选羟自由基清除剂的方法。关键词:羟自由基;Fenton反应;结晶紫;分光光度法中图分类号:O657.32��������文献标识码:A0�引言羟自由基是一种氧化能力很强的自由基,能很容易地氧化各种有机物和无机物,是造成生物组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的重要活性氧。因而对羟自由基的研究和探讨,对揭示生物体的生命过程及有毒有机污染物控制和对机体抗衰老、肿瘤等形成的了解,寻找清除羟自由基及降解有毒物质具有十分重要的意义。因此,对羟自由基的研究在生命科学及环境科学等领域中引起了广泛的兴趣。由于羟自由基的反应活性大,寿命短,存在浓度低,所以在有关羟自由基的研究中,其分析检验方法对于羟自由基的作用研究有重大意义,特别是在测定及筛选抗羟自由基物质的方面具有重要价值。近年来国内外文献报道了检测羟自由基的重要方法有:电子自旋共振法、高效液相色谱法、化学发光法、荧光法、光度法等。电子自旋共振法和高效液相色谱法操作复杂,仪器昂贵;化学发光法虽然操作简便,测定快速,但仪器普及不广。本实验采用结晶紫作为显色剂,用分光光度法测定Fenton反应产生的�OH,具有操作简便,费用低,易于广泛使用的优点。1�试验部分1�1�仪器与试剂7200型可见光分光光度计(尤尼柯仪器有限公司);PHS-3C数字酸度计(杭州东星仪器有限公司)。实验用试剂浓度:0�4mmolL-1结晶紫溶液;1�0mmolL-1硫酸亚铁;2�0mmolL-1过氧化氢溶液;1�0mmolL-1抗坏血酸溶液;1�0mmolL-1硫脲溶液;1�0mmolL-1复方丹参;1�0mmolL-1磷酸二氢钾。以上试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。1�2�实验原理结晶紫分光光度法测�OH基本原理是:H2O2和Fe2+发生Fenton反应产生�OH。�OH容易进攻高电子云密度点,会与结晶紫中具有高电子云密度的C=C基团发生亲电加成反应,而使结晶紫褪色。通过测定结晶紫吸光度值的变化可间接测定出�OH的生成量。Fe2++H2O2Fe3++�OH+OH-1�3�实验方法羟自由基的产生与检测:在一系列50mL具塞比色管中分别加入1�5mL结晶紫(0�4mmolL-1),2�0mLFeSO4溶液(1mmolL-1),1�0mLH2O2溶液(2�0mmolL-1)。调pH值到4�0,稀释到50mL并摇匀,放置30min后,测580nm处的吸光度Ab,同时测定不加H2O2时580nm处的吸光度A0。则羟自由基的产生量可以用�A=A0-Ab来表征。武�汉�工�业�学�院�学�报2005年表观抗羟自由基氧化率的测定:在上体系中加H2O2之前加入一定量的抗氧化试剂,测定其吸光度As则表观抗羟自由基氧化率S可以按下式计算:S(%)=(As-Ab)/(A0-Ab)!100%2�结果与讨论2�1�紫外吸收光谱按试验方法作紫外吸收光谱,见图1。其中曲线1代表未加H2O2时结晶紫体系的吸收曲线(非氧化体系),曲线2代表加了H2O2时结晶紫体系的吸收曲线(氧化体系),非氧化体系和氧化体系中,在580nm处均有最大吸收值,但氧化体系中吸光度要小,这说明羟自由基对结晶紫有较强的褪色作用。图1�结晶紫体系的吸收曲线2�2�结晶紫浓度的影响加入不同体积的结晶紫溶液(0�4mmolL-1),我们发现随着结晶紫量的增加,�A值也增大,当结晶紫用量为1�5mL时�A有最大值,故本实验将结晶紫的用量定为1�5mL。且此时的A0与Ab均在准确测量范围以内。2�3�酸度的影响在pH值=3�5时最有利于Fenton反应的进行。反应发生后体系的pH值一般会上升1�5左右。pH值=6左右时,Fe3+便会生成Fe(OH)3沉淀,会干扰�OH的测定。在pH值�3�0的酸性溶液结晶呈紫色。综合反应稳定性考虑,本实验的pH值选择4�0。2�4�稳定性实验反应30min后,室温下Ab变化缓慢,可见本法的稳定性较