1株反硝化除磷菌的鉴定及其反硝化功能基因研究

7期张倩等:1株反硝化除磷菌的鉴定及其反硝化功能基因研究图3菌株ZQN2透射电镜照片(×20000)Fig．3TEMphotoofstrainZQN2图4所示．此厌氧释磷/缺氧吸磷特性试验是模拟SBＲ反应器160min厌氧/180min缺氧的模式运行一个周期．由于时间较短，菌体细胞的增殖不多．因此，在本试验中忽略菌体细胞的增殖情况．图4菌株ZQN2厌氧释磷/缺氧吸磷结果Fig．4Anaerobicphosphorusrelease/anoxicphosphorusuptakeofstrainZQN2表3菌株ZQN2生理生化鉴定结果1)Table3Identificationbybiochemicalproperties项目革兰氏染色淀粉水解葡萄糖氧化发酵产吲哚明胶液化接触酶氧化酶M．Ｒ．V．P．柠檬酸盐利用硝酸盐还原鉴定结果++++++－－+++1)“+”为阳性，“-”为阴性由图4可知，在160min厌氧条件下，培养液中PO3－4-P浓度由初始的8mg·L－1增加到21.37mg·L－1，相应的菌体中PHB含量由初始的6.72mg·L－1增加到16.83mg·L－1;在缺氧开始时向培养基中投加KNO3使其NO－3-N浓度达到30mg·L－1，缺氧结束时NO－3-N浓度降至2.86mg·L－1，PO3－4-P浓度降至3.14mg·L－1，菌体中PHB含量降至2.04mg·L－1．可以看出，厌氧段PHB含量随着释磷量的增加而增加，但在随后的缺氧段却随着吸磷量的增加而减少．由此可知，菌株ZQN2遵循了典型的反硝化除磷菌的代谢模式［30］，即在厌氧条件下，菌株ZQN2分解体内的多聚磷酸盐(异染颗粒减小)产生能量，并释放出磷酸盐(环境中PO3－4-P含量增加)以维持菌株的代谢，同时将胞外有机物摄入胞内(环境中有机物含量降低)并合成PHB(菌体内PHB含量增加)，合成PHB的能量来自聚磷酸盐分解过程中产生的能量;缺氧条件下，菌株ZQN2以NO－3-N为电子受体(环境中NO－3-N含量减少)，分解利用厌氧段合成的PHB产生能量(菌体内PHB含量降低)，大部分供给细胞合成，维持生命活动，另一小部分过量摄取环境中的无机磷酸盐(环境中PO3－4-P含量减少)，并以聚磷的形式储存于菌体内(异染颗粒增大)．因此，菌株ZQN2具有反硝化和除磷的能力，是一株典型的反硝化除磷菌，能在缺氧条件下以NO－3-N为电子受体氧化菌体内厌氧段合成的PHB，并过量吸磷，进行了同步反硝化除磷．2.316SrＲNA系统发育分析提取菌株ZQN2的基因组总DNA，以BSF08和BSＲ1541为引物，经PCＲ扩增后，获得ZQN2菌株16SrＲNA约1500bp的扩增片段，NCBI登录号为GU384232．将该序列用BLAST程序对GenBank数据库进行探索比较，结果表明，菌株ZQN2与Bacilluscereus的亲缘关系最接近，具有99%以上的相似性．采用MEGA程序将该菌株与数据库中已报道菌株进行了系统发育进化分析，并绘制系统发育树，如图5所示．结合菌株ZQN2的生理生化鉴定结果，将菌株ZQN2最终鉴定为蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus)．2.4反硝化功能基因的系统发育分析与相对保守的16SrＲNA相比，功能基因具有更多的序列变化，利用功能基因可以区分生态功能不同但亲缘相近的微生物种群，但更重要的是利用功能基因可以鉴定生态功能相同但亲缘较远的微生9782环境科学34卷图5用NJ法构建的基于16SrＲNA序列同源性菌株ZQN2的系统发育树Fig．5Phylogeneticneighbor-joiningtreebasedon16SrＲNAfromstrainZQN2物种群，如反硝化菌．亚硝酸盐还原酶Nir分为2种:Cu型亚硝酸盐还原酶和细胞色素cd1型亚硝酸还原酶，分别由nirK和nirS基因编码．本试验中使用6对引物扩增nirK基因，但扩增结果都呈阴性，即没有扩增出nirK基因条带．nirS基因的PCＲ扩增所使用引物为cd3aF和Ｒ3cd，经PCＲ扩增后结果呈阳性，GenBank登录号为GU563985．结合nirK基因扩增结果可知，菌株ZQN2为nirS+和nirK－型．这与一般普遍的观点相同，即认为同一株菌中不会同时出现这2种基因．但是也有人发现了能同时含有这2种基因的菌株［31］．此结果表明菌株ZQN2中的确存在亚硝酸盐还原酶，它催化了反硝化反应的进行．对该nirS功能基因片段进行测序并利用MEGA程序将其与已报道的nirS基因片段进行了系统发育进化分析，并绘制了系统发育树，如图6所示．图6用NJ法构建的基于nirS序列同源性菌株ZQN2的系统发育树Fig．6Phylogeneticneighbor-joiningtreebasedonnirSfromst