多管发酵改良法在饮用水耐热大肠菌群检测中的应用

作者简介:雷务年(1970－)，男，大专，主管技师，主要从事卫生检验检测工作。·经验交流·多管发酵改良法在饮用水耐热大肠菌群检测中的应用雷务年，黄华国，石威，谢艳芳钦州市钦北区疾病预防控制中心，广西钦州535099关键词:生活饮用水;总大肠菌群;耐热大肠菌群;多管发酵法中图分类号:TS201．3文献标识码:C文章编号:1004－8685(2014)20－3034－02我国生活饮用水标准中规定需同时检测总大肠菌群和耐热大肠菌群且每100ml水样中均不得检出。由于总大肠菌群在人畜粪便中数量巨大，检测方法较为简单且概率高，对各种化学因子的抵抗力与肠道致病菌相当所以被作为粪便污染的指标菌［1］。目前检测生活饮用水大肠菌群和耐热菌的方法有酶底物法、PCＲ法、滤膜法等，但这些检测耐热大肠菌的方法技术还不成熟［2］。多管发酵法(MFT)有实验步骤复杂、干扰因素多、检测时间长等缺点，但是更具有检测成本低、易于推广、原理简单及不受水质浊度的影响等优点，在目前国情下还有其存在的长期性和必要性［3－5］。在应用MFT的检测工作中偶尔会出现耐热大肠菌群数＞总大肠菌数的不合理情况，这个问题虽然鲜见报导，但已困扰检验和公卫人员多年。经过多年的工作实践研究，找出了出现这种情况的原因，并通过对检测程序的改良，有效地杜绝了这种情况的发生。1对象与方法1．1对象以2013年钦北区农村供水工程监测点为研究对象，在丰水期和枯水期采集水样进行检测。共采集水样80份，出厂水和末梢水各40份。1．2方法检测方法按照《生活饮用水标准检验方法》(GB/T5750－2006)进行［6］。1．2．1总大肠菌群和耐热大肠菌群多管发酵法常规检测方法(简称原法)(1)初发酵试验:取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，取1ml接种到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1ml水样注入到9ml灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml注入到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。接种管置(36±1)℃培养箱内，培养(24±2)h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气，则可报告为总大肠菌阴性，如有产气者，则按下列骤进行。(2)分离培养:将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂(EMB)平板上，于(36±1)℃培养箱内，培养18h～24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰染色、镜检和证实试验:深紫黑色，具有金属光泽的菌落;紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落;淡紫红色，中心色较深的菌落。(3)证实试验:经上述染色镜检为革兰阴性无芽胞杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置(36±1)℃培养箱内24h，有产酸产气者，即证实为总大肠菌群。(4)耐热大肠菌群检验步骤:自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管(产酸产气)中取1滴转种于EC培养基，置44．5℃水浴箱中，培养18h～24h，如所有管均不产气，可报告为阴性。如有产酸产气者，转种在EMB上，置44．5℃培养箱内培养18h～24h，凡平板有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群。1．2．2改良法耐热大肠菌群检验步骤:取1．2．1(3)用作验证总大肠菌群相同的菌落同时接种另一支乳糖蛋白胨培养液，置44．5℃水浴箱中，培养(24±2)h，如所有管均不产气，可报告为阴性。如有产酸产气者，则证实为大肠菌群。1．3统计学处理用SPSS11．5统计软件进行统计学分析，采用配对t检验和相关性分析。2结果80份水样原法和改良法均同时检出总大肠菌群35份，并同时检出耐热大肠菌群30份，未出现原法检出而改良法未检出现象。原法中出现一份水样耐热大肠菌群数＞总大肠群数。两法检测阳性管结果见表1。MFT得出试验阳性管后，需对照GB/T5750－2006．12方法中大肠菌群最可能数(MPN)检索表，得出总大肠菌群数和耐热大肠菌群最可能数。在检测表中可以看出，由于原法与改良法检测总大肠群使用相同的检验样品和检测程序，得出的总大肠菌群数是相同的。将表1中的2组耐热菌的数据输入SPSS11．5软件进行统计学处理，原法和改良法相关系数·4303·中国卫生检验杂志2014年10月第24卷第20期ChinJHealthLabTec，Oct2014，Vol24，No20r=0．985，表明2组数据有相关关系，相关数的双侧统计学检验P=0．000，P＜0．001，说明原法与改良法测定结果之间具有显著的正相关性。原法和改良法双侧配对t检验结果P=0．115，P＞0．05，结果差异无统计学意义，说明用原法和改良法检测耐热大肠菌群之间无统计学意义。表1原法与改良法检测阳性结果(MPN/100ml)方法大肠菌群1234567891011121314151617181920212223242526272829303132333435原法总17109319209203503113920350707054