产蛋白酶混合菌系对碱性剩余污泥水解酸化的影响

第４６卷第１２期２０１４年１２月哈尔滨工业大学学报ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＨＡＲＢＩＮＩＮＳＴＩＴＵＴＥＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ的处理费用约占污水处理厂运行成本的６０％［３］．因此，采用适当方法对污泥进行处理和处置成为污水处理厂的首要任务［４］．目前，剩余污泥的处理及处置方法多种多样，如焚烧、填埋、海洋倾弃等［５－６］．然而这些方法均会对环境产生负面影响．生物营养物质（氮和磷）的去除是减轻水体富营养化的一种有效途径．污水中易于生物降解的有机物，如挥发性脂肪酸（ｖｏｌａｔｉｌｅｆａｔｔｙａｃｉｄｓ，ＶＦＡｓ）显著影响着生物营养物的去除效率．然而，污水中ＶＦＡｓ质量浓度往往较低．污水生物处理时如人为添加外碳源，会在一定程度上增加运营成本．近年的研究表明，污泥发酵产生的ＶＦＡｓ既可作为生物营养物去除的内碳源，又可起到污泥减量的作用，从而降低运营成本［７－８］．污泥厌氧消化包括水解、酸化和产甲烷３个阶段．水解反应通常被认为是污泥厌氧消化的限速步骤，该反应产生的ＶＦＡｓ可被产甲烷菌利用［９］．为了降低水解阶段的影响，各种预处理方法已应用于加速污泥水解或改善污泥厌氧消化工艺［１０－１１］．蛋白质和碳水化合物是剩余污泥中的主要有机物，在剩余污泥酸化阶段可以被转化为ＶＦＡｓ，且乙酸和丙酸是污水处理厂用于脱氮除磷工艺优选的有机碳源［１２－１４］．近年的研究表明，污泥厌氧发酵过程中ｐＨ及污泥中微生物群落结构显著影响ＶＦＡｓ的产量及组分［４，１４－１５］．然而，关于接种微生物对剩余污泥水解酸化过程中ＶＦＡｓ产量影响的研究却鲜有报道．本研究从剩余污泥中分离产蛋白酶活力较高的耐碱细菌，并构建产蛋白酶混合菌系．将该混合菌系接种于碱性（ｐＨ１０．０）发酵剩余污泥的不同时期，评价其在碱性条件下对溶解性化学需氧量（ＳＣＯＤ）、溶解性蛋白质和碳水化合物、ＶＦＡｓ等的影响，探讨利用剩余污泥生产ＶＦＡｓ的最佳条件．同时有助于了解ＶＦＡｓ积累的机制，有益于剩余污泥的资源化利用．１实验１．１污泥来源实验所用剩余污泥均取自哈尔滨太平污水处理厂二沉池．污泥取回后静置２４ｈ，弃上清液，于４℃保存备用．浓缩后的剩余污泥ｐＨ为６．８２，总固体（ＴＳ）质量浓度为１３．６８ｇ／Ｌ，挥发性固体（ＶＳ）质量浓度为１０．３６ｇ／Ｌ，ＳＣＯＤ为１４２．２１ｍｇ／Ｌ，溶解性蛋白质质量浓度为７６．３２ｍｇ／Ｌ，溶解性碳水化合物为３０．８７ｍｇ／Ｌ．１．２培养基基础培养基：１０ｇ脱脂奶粉，３ｇ酵母提取物，０．５ｇ氯化钠，６．７ｇ硫酸铵，０．５ｇ硫酸镁，０．７ｇ磷酸二氢钾，１．２ｇ磷酸氢二钾，１Ｌ蒸馏水，ｐＨ１０．０，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ．透明圈培养基：１０ｇ脱脂奶粉，５ｇ蛋白胨，２．５ｇ酵母提取物，１０ｇ可溶性淀粉，０．５ｇ磷酸二氢钾，０．５ｇ硫酸镁，１ｇ氯化钠，２０ｇ琼脂，１Ｌ蒸馏水，ｐＨ１０．０，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ．产酶液体培养基：４０ｇ葡萄糖，２０ｇ蛋白胨，１．４ｇ磷酸氢二钠，０．６ｇ氯化钙，０．４ｇ硫酸镁，１Ｌ蒸馏水，ｐＨ７．０～７．２，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ．ＬＢ培养基：１０ｇ胰蛋白酶胨，５ｇ酵母提取物，５ｇ氯化钠，１Ｌ蒸馏水，ｐＨ７．０～７．２，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ．１．３菌株的分离鉴定及蛋白酶活力的测定将１ｇ剩余污泥接种于２５０ｍＬ基础培养基中，１２０ｒ／ｍｉｎ、３０℃厌氧培养４８ｈ．将培养液适当稀释后涂布于琼脂基础培养基中，３０℃厌氧培养４８ｈ．挑选长势良好的单菌落，并重复以上步骤直至获得纯培养．将初筛获得的菌株分别涂布于透明圈培养基中，３０℃厌氧培养４８ｈ，挑取水解圈直径与菌落直径比值较大的单菌落，并分别接种于不同条件下的产酶液体培养基中，厌氧培养４８ｈ后，采用Ｆｏｌｉｎ试剂显色法测定其酶活力［１６］．ｐＨ１０．０、３０℃条件下，以１ｍＬ酶液每分钟水解酪蛋白产生１μｇ酪氨酸所需酶量定义为１个酶活力单位．将分离获得的产蛋白酶活力较高的菌种进行鉴定，具体方法见文献［１７］．测序得到的１６ＳｒＤＮＡ序列提交至ＧｅｎＢａｎｋ数据库，并通过ＮＣＢＩ的ＢＬＡＳＴＮ程序对测序结果进行同源性分析，获得相关种属的序列信息，采用ＭＥＧＡ５．１软件进行系统发育分析．１．４混合菌系的构建将分离到的菌株分别接种于２５０ｍＬＬＢ培养基中，１２０ｒ／ｍｉｎ、３０℃厌氧培养１２ｈ后，调节培养基ｐＨ至１０．０，１２０ｒ／ｍｉｎ、３０℃继续厌氧培养３６ｈ，使菌株能够在接种污泥后快速适应碱性发酵条件．发酵液分别以６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，菌体沉淀用无菌水洗涤并离心２次．以无菌水分别将各菌体质量浓度调节至ＯＤ６００为０．８，并将其１∶１混匀后作为接种物，即混合菌系．１．５序批实验本研究采用序批式发酵，用２ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液将３．５Ｌ剩余污泥调节ｐＨ至１０．０后，平均分配到０～４号反应瓶（