微板吸光法在藻类毒性分析中的应用

※农业科学农业与技术2015,Vo1．35,No．14J微板吸光法在藻类毒性分析中的应用李适云，何裕坚，张宏涛(佛山市环境健康与安全评价研究中心，广东佛山528000)摘要：本文通过细致分析与探究微板吸光法用于测定环境毒物对藻生长的抑制效应，指出微板吸光法是1种以微藻为指示生物，置于96孔板培养，用酶标仪连续测定其吸光度，从而评价毒物毒性的方法。大量试验成果可证实该法具有所需样品量少、易于设置多浓度、节约时间、与标准锥形瓶法有良好一致性等优点，是1种切实可行的检测方法。因此，随着社会的发展，环境样品和有毒化学品检测数目的极速增长，该法仍具有继续扩大基础研究，强化实际应用性能的意义。关键词：微板吸光法；毒性试验；生态毒理；藻类；酶标仪中图分类号：X55文献标识码：AD0I：10．11974／nyyjs．20150733001藻类是水体的初级生产者，对维持水生生态系统的稳定性起着十分重要的作用。此外，藻类繁殖快，个体小，对环境毒物敏感，容易在实验室条件下培养。因此，评价污水、农药等环境样品的生态毒性时都把藻类生长抑制效应作为标准毒性测试方法，如经济合作与发展组织OECD和中国国家环境保护总局【2等。但标准测试法一般都用锥形瓶作为藻类培养的容器，进行试验时，存在样品体积大、工作量大、试验条件难以维持一致等缺点。随着环境样品检测数目的增加，亟须找到一种高效便捷的测试方法。1微板吸光法的概述细胞计数法、可见分光光度法、荧光分光光度法和叶绿素a含量测定法是目前测定微藻生长情况的基本方法I2J。据报道，对不同培养时间、不同生理状态的微藻进行光谱扫描也能获得一致的吸收峰，其测得的光密度值(OD值)与细胞计数密度值具有良好的线性拟合相关性，表明可见分光光度法可用来真实反映微藻在培养过程中的生长情况【3J。可见分光光度法凭借其方便快捷、重复性、准确性等特点而被广泛使用。同时结合酶标仪多孔自动化检测性能，1种高效新型的测定方法应运而生——微板吸光法。微板吸光法已常用于微生物的毒性试验中，进而让微板吸光法作为藻类生长抑制试验的测试手段奠定了坚实的理论基础。2微板吸光法的特点纵观国内外学者利用微板吸光法进行的藻类毒性试验，可总结出以下特点：PAIXAO等[41将微板法与锥形瓶法进行比较，发现其试验结果比较一致；孙禾琳等[5】用微板吸光法对多钟持久性有机污染物(POPs)进行毒性评价，证实微板吸光法所需样品量少，成本降低，可以快速测定微藻的毒性；SATOH等嘲也用该法测试了Cu，As，Sb，Pb和Cd对9种微藻的毒性，表明该种方法对多种藻类都适用，且方便设置多个平行和多个浓度；Geis等证明微板试验操作简单，节省时间，降低平行测定的变异，显著提高空白试验的重复性。3微板吸光法应用于藻类毒性试验3．1测定藻类生长抑制效应先摸索藻类在微板吸光法中的最佳波长、pH、暴露时间等条件，将藻种进行活化和多次预培养，使其在合适的条件下长至对数生长期，试验前1～2d转接藻种至新鲜培养基，待其OD值为0．10左右备用。为了防止边缘效应的产生，在96孔板的四周36个孔中加入250uL去离子水；空白对照组的孔加入100|IL去离子水和150laL藻液；试验组的孔加入100llL受试物试验液和150uL藻液。向微板加透明盖后置于适宜的条件下培养，在试验的oh、24h、48h、72h振荡微板5s，将其放入酶标仪中，测定微藻的OD值。对浓度．效应曲线进行拟合，即可算出半数抑制浓度EC50及95％置信区间嘲。3．2用于农药高通量筛选的研究新农药的研发需要合成筛选上万个化合物，以常规的温室盆栽法和培养皿法作为初筛法，是很难在短时间内完成的。微板吸光筛选法不仅能缩小测试规模，而且农药用量少、筛选速度也快。对于一些只能得到微克级的农药，微板吸光法更简单易行。严航贞等唧提出用该法测定除草剂活性，并与标准锥形瓶法的结果作比较，得出二者结果相符，证实微板吸光法可作为农药高通量筛选的1个备选方法。4日前还存在的问题由于微板孔体积很小，需要考虑测试载体、光照均匀性、蒸发量等条件对藻毒性试验结果的影响，但关于上述影响因素的系统研究却很少；个别微板吸光法的结果拟合系数较低，需提高试验的重复性，进一步优化试验方法；微板的材质、试验中振荡频率不足，会导致藻类容易沉降或黏附在微板壁上，测得OD值偏低；微板孔中添加藻液和受试物的量都较少，易产生误差，因此在试验中要尽量设置多个平行及浓度；对于一些颜色较深的试验样品，有可能会导致OD值偏高n0】，进而影响微板吸光法的准确性。5结语虽然，目前有实际的应用问题仍需解决，微板吸光法测定藻毒性的试验条件还不够成熟，但该法在投入更少成本、时间、用量的情况下，却能处理更多样品、便于多浓度多平行测试，适合测试量少的环境样品、新型化合物和昂贵化学品。这使得扩大微板法测试范围的基础