高丁醇比丙酮丁醇梭菌的选育与应用_张益棻

1996年第26卷第4期工业徽生物一1一高丁醇比丙酮丁醇梭菌的选育与应用.张益某陈军杨蕴刘焦瑞身(中国科学院上海植物生理研究所20302)摘要设计了专一性分离方法,从土样中分离了多株能产生溶荆的梭菌,经多次单细胞分离、纯化,再经亚峭基膝和甲墓嘴酸乙醋诱变和杭性筛选,获得几株高丁醉的丙酮丁醉梭菌。对高产菌林的性状稳定性、发酵过程、混合原料应用、温度的影响进行了研究。结果证明菌株性状稳定,丁醉产量为总溶剂的70%,过程为典型的丙酮丁醉发酵,对温度可衬受到39一4o0C,能利用玉米和薯干,玉米和高粱进行正常发酵。菌株已在百叱生产堆,连续应用一年以上,丁醉占总溶剂的71.9%,进一步脸证了高丁醉性状的稳定性。关键词:丙酮丁醉校菌,丁醉高产菌株,溶剂发酵丙酮丁醇梭菌(Clo:f万成别加arerobot夕21-`:二)的发酵是一个古老的发酵工业,已有80年历史。在这漫长的历程中它积累丰富的生产经验,也经历了兴起、发展和衰落的过程『卜目。由于石油化工合成技术的迅速发展,在60年代英美等国溶剂发酵已经停止,但在石油资源缺乏或技术较差的国家和地区,这一发醉仍在维持。70年代中期石油资源发生危机后,人们对可再生能源加以重视,认为是化石能源枯竭后,人类可依赖的能源,于是应用这些木质纤维素进行各种微生物发醉的研究兴起,丙酮丁醇梭菌当然受到重视。试观最近两次(1990与19叫)国际工业微生物遗传(GenetiesofIndustrialMieroor-gaulsms)学术会议,都有专题讨论梭菌遗传、生化代谢与基因克隆等,看来梭菌的基础研究出现了复苏【.,。我国丙酮丁醇梭菌发酵也受到石油化工合成技术的剧烈竞争,但在玉米产地由于成本较低,溶剂发酵仍有效益,如有高丁醇菌种可以利用,则效益更佳。本文报导的是`七·五”期内承担原由化工部科技司提交的高丁醇菌选育课题的研究成果。工作包括土集分离、初步筛选和强烈因子多次诱变,又结合生产实践要求进行原料试验、温度影响等实验,结果证明所选育的菌种是稳定的。最近又在生产厂连续生产条件下进行扩大试验,进一步证明菌种的稳定性,总溶剂在209/L,其中丁醇稳定在71.9%。材料和方法培养基1.1.1由土样分离菌种用马铃薯块茎1.1.2分离纯化用培养基牛肉膏0.5%,蛋白陈1%,醉母膏0.5%,氯化钠0.5%,葡萄搪0.5%,琼脂2.5%,PH6.5!.1.3测定菌种生长曲线用培养基葡萄糖4%,胰蛋白陈0.6%,`七·五,国家重点科技攻关项目一2一工业傲生物1996年第26卷第4期醋酸钱0.3%,酵母粉0.2%,MgSO`·7HZO0.02%,KZHPO。0.05%,FeSO`·7H:00.001%,PH6.51.1.4发酵用培养基7%或8%玉米醒1.2菌种分离与纯化(1)从上海郊县采集大豆根际土壤样品64份。(2)马铃薯用打洞器打洞,深约cIm。打洞器内的马铃薯小条切去一半做塞子备用。在已打好的洞内加入少许土样,后再加50川正丁醇,塞上马铃薯小块,用石蜡封口后将马铃薯浸没水中,3o7C温室培养。(3)当浸没在水中的马铃薯接种处产生气抱时,将马铃薯从水中取出,取出作为塞子用的马铃薯小条,将培养物接入5%玉米醛试管中,放在37oC培养。(4)玉米醒产生气泡,或打开试管嗅出略有溶剂味者,再转接入5%玉米醒中,置3o7C培养,嗅出溶剂味重者进行分离。1.3诱变育种我们用过的诱变剂有甲基磺酸乙醋(EMS)和亚硝基肛(NTG)。1.3.1EMS处理菌液浓度一般是107细胞/ml,取sml菌液,加犷mlo.2MEMS,置于无菌试管中,充分混合,37℃振荡处理Zh后加入固体硫代硫酸钠中止反应。平板培养基加丙烯醇作为拮抗剂,浓度为50挤g/ml。培养皿置于干燥器内抽真空后37℃培养%h。1.3.2NTG处理将菌液在平皿上涂匀后在平板中心处加一小粒NTG,培养皿置于干燥器内抽真空后37oC培养%h。1.`分析方法1.4.1溶剂溶剂用气相色谱测定,(气相色谱仪为102型,上海分析仪器厂出品)lm柱装填涂有聚乙二醇的红色担体,气化温度20。℃,载气为氮气,色谱数据分析用上海计算机研究所的CDMC一IB型色谱数据处理机。1.4.2菌体生长(浊度)用UV一120型〔日本岛津公司产),O..D200nm测定。1.4.3PH测定用pH计(上海第二分析仪器厂产pHS一2型)测定。1.牛.4酸度测定取10ml缪液加入30ml蒸馏水,再加入2滴酚酞,用0.INNaOH滴定,耗用的碱液毫升数即为该酶液的酸度。1.4.5有机酸用气相色谱测定,2米不锈钢柱装80一100目Porapak一Q,气化温度200oC,载气为氮气,色谱数据分析用上海计算机研究所的CDMC一IB型色谱数据处理机。1.牛.6糖测定使用上海溶剂厂方法:用一定量的显色剂与定量的糖液(或水解后的醒液)进行反