混合菌修复石油污染土壤的最佳方案

采用LB培养基保藏4种单菌。将模拟土样按每份50g分别装入80个锥形瓶中，并将锥形瓶分成5组，每组16个。取其中4组分别以50.0mL/kg的接种量加入A，B，C，D菌悬液，置于28℃恒温箱中。剩余1组未加菌种，作为对照样考察土著微生物的修复作用。每间隔一段时间取样，采用重量法测定土壤试样中石油的含量，计算石油降解率。1.2.2优势菌群的构建和最佳配比的确定对4种菌进行2种、3种、4种的组合，分别将不同组合的混合菌按一定的接种量加入到模拟土样中，每组加入的混合菌菌悬液的总接种量均为50.0mL/kg，各加入菌的接种量分别相等。在28℃的恒温箱中放置40d后，测定土壤试样中石油的含量，计算石油降解率，从而构建出优势菌群。采用均匀设计法对优势菌群的配比进行优化。1.2.3培养条件优化实验选取5个影响石油降解率的代表性因素：混合菌接种量、土壤含水率、鸡粪加入量、麦糠加入量和表面活性剂加入量，并将其控制在不同水平，采取均匀设计考察各因素对修复效果的影响。按确定的最佳配比将4种菌接种到石油污染土壤中，在28℃的恒温箱中放置40d后，测定土壤试样中石油的含量，计算石油降解率。1.3分析方法1.3.1土壤理化性质测定方法采用电位法测定土样pH，水与土的体积比为2.5；重铬酸钾容量法测定模拟土样的有机质含量；半微量凯氏法测定模拟土样的总氮含量；钼锑抗比色法测定模拟土样的总磷含量。1.3.2土壤酶活性及微生物种群数量的测定采用TTC法测定模拟土样中脱氢酶的活性，奈氏比色法测定脲酶的活性，邻苯三酚比色法测定多酚氧化酶的活性，高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶的活性；采用菌落形成单位CFU计数测定土壤的微生物种群数量。2、结果与讨论2.14种单菌与土著微生物对石油降解率的影响4种单菌与土著微生物对石油降解率的影响见图1。由图可见：使用4种单菌时石油降解率的高低顺序为D>C>A>B，且均高于土著微生物；D菌处理40d后，石油降解率达30.08%，而土著微生物处理40d培养后的石油降解率仅为5.02%。2.2优势菌群的构建和最佳配比的确定混合菌的配比对石油降解率的影响，当A，B，C，D4种菌混合使用时，石油降解率最高，达到40.02%。采用U11（114）均匀设计表进行实验，确定A，B，C，D4种菌的最佳配比。U11（114）均匀设计的实验方案和结果见表2，其中：X1为A的质量分数，X2为B的质量分数，X3为C的质量分数，X4为D的质量分数。U11（114）均匀实验的数据处理采用UniformDesign2.10软件，得出回归方程见式（1）。方差分析表中显著性水平为0.009<0.01，回归方程变量间关系是极显著的。混合菌的最佳配比为：X1=12%，X2=2%，X3=21%，X4=65%，预测最高石油降解率为54.30%。在最佳配比条件下进行验证实验，石油降解率为54.50%，与预测结果的误差为0.37%。实验值与预测值的误差在允许范围之内，说明均匀设计优化的菌种配比准确可信。2.3培养条件优化实验采用U14（148）均匀设计表进行实验，研究各培养条件对石油降解率的影响。U14（148）均匀设计的实验方案和结果见表3。其中：U1为混合菌接种量，U2为土壤含水率，U3为鸡粪加入量，U4为麦糠加入量，U5为表面活性剂加入量。U14（148）均匀实验数据的处理采用UniformDesign2.10软件，得出回归方程见式（2）。方差分析表中显著性水平为0.001<0.01，回归方程变量间关系是极显著的。菌群的最优培养条件为：混合菌接种量122.0mL/kg、土壤含水率14%（w）、鸡粪加入量90g/kg、麦糠加入量150g/kg和表面活性剂加入量22mL/kg，预测最高石油降解率为67.35%。在最优培养条件下进行验证实验，石油降解率为66.95%，与预测结果的误差为0.59%。实验值与预测值的误差在允许范围之内，说明均匀设计优化的菌群培养条件准确可信。2.4微生物修复前后土壤性质的对比分别将未经处理的模拟土样、经土著微生物通风堆肥法处理的模拟土样、经混合菌处理（最佳配比及最优培养条件下）的模拟土样记作M1，M2，M3，考察微生物修复前后土壤理化性质、酶活性和微生物种群数量的变化。M3的修复效果最好，石油降解率达66.95%，而M2的石油降解率仅为5.02%。由于M3在修复过程中投入了大量的营养物质，因此土样中有机质和总氮含量大幅提高；而M2的各指标变化则不如M3的明显。M3中脱氢酶和过氧化氢酶活性最高，这是由于在修复过程中土壤微生物大量繁殖，微生物参与了石油烃的降解过程，使得脱氢酶和过氧化氢酶活性提高。M3中的脲酶活性最高，说明土壤的氮元素转化能力强，有利于土壤中微生物的生长，为微生物参与石油烃的降解提供了充足的营养条件。而M2中各种酶活性的变化均不如M3中明显。