基于细菌脱氢酶活性法的水质综合毒性快速测定仪_王立世

第31卷第1期1998年3月南开大学学报(自然科学)AetaSeientiarumNatuarliumUnievsritatisNankaiesnisVol.31附1Mar.1998护套去去去告*架研究简报介带带攀举举带求基于细菌脱氢酶活性法的水质综合毒性快速测定仪王立世张宝贵陈叙龙冯建兴(南开大学环境科学系,天津,300071)张林孙咏梅王军(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津,300050)摘要在无氧条件下,生物染料亚甲基蓝可以作为生物新陈代谢过程中体内脱氢酶催化反应的电子受体,亚甲基蓝与细菌悬液共存时,其退色速度标志着细菌脱组醉活性的大小.脱氮醉的活性大小在一定程度上能够反映出微生物新陈代谢的能力,徽生物所处的水环境中毒物的存在会引起微生物脱氢酶活性变化,毒物的毒性与脱氮酶的活性相关.本文以动力学比色法测定亚甲基蓝的退色速度为基础设计并制造了一台水质综合毒性快速测定仪,测定若干种化合物的毒性,并与Mierotox方法、标准鱼类方法和鱼类呼吸频率方法进行比较.结果显示该方法费用低、速度快、操作简单,具有很大的发展潜力.关键词:细菌;脱氢酶;毒性随着工业生产的发展,各种工业污水排放量越来越大,污水的成份越来越复杂,其中不少对人和其它生物是有毒的.传统的高等动物毒性试验方法1[]耗时长、费用大、重现性差,难以满足当前环境保护的需要.因此,急待建立一种简便、快速、灵敏、价廉的生物监测系统.D.iLu川曾描述一种微生物脱氢酶活性,用于测定环境水样的毒性,他是采用刃天青作为氧化还原染料,指示脱氢酶的活性,但他所提出的操作程序复杂、耗时长、实验条件苛刻,而且效果不佳.我们在此基础上对该方法进行了较大的改进,使用亚甲基蓝作为指示剂并使之仪器化,与其它方法比较具有设备简单、操作方便、重现性好、费用低等优点.方法原理微生物新陈代谢过程中,脱氢酶将有机质的氢脱下,使有机质氧化,并将氢转移给氧化型化合物,在无氧条件下亚甲基蓝(蓝色)接收氢转化成还原型亚甲基蓝(无色).H}众呱·S·bstr一群众一(CH3)ZNv丫丫N(CH3)ZCI(CH3)ZNW弩岁N(CHs)ZCI(蓝色)(无色)收稿日期:1997一03一28第1期王立世等:基于细菌脱氢酶活性法的水质综合毒性快速测定仪因此,在无氧反应系统中,亚甲基蓝的脱色速度可表征酶的活性大小,脱氢酶受毒物作用活性降低,降低的程度与毒物毒性成正相关关系,所以可以用毒物对脱氢酶活性的影响确定其毒性大小.亚甲基蓝的退色速度是通过比色法测定的,光源采用橙色发光二极管,其最大发光光谱带为610nm至665nm,亚甲基蓝的吸收光谱为62Onm至660nm,两者正好匹配并有较佳的灵敏度.采用占空比为1:10的脉冲发生器来点燃发光二极管,可在平均电流不超过发光二极管的额定耗散功率下大大提高其脉冲发光强度,改善信噪比.光线通过样品池后,其强度为光敏三极管所检测,经交流放大和相敏解调为直流讯号,再直流放大成为可测量信号,由于光电检测器测量的是脉冲信号,操作可以在不避光的条件下进行.我们采用单片机系统检测信号的变化,判断并记录亚甲基蓝最大退色速率附近,信号变化一定范围所需要的时间,用于计算样品的相对毒性和EC50值.相对毒性A采用如下公式计算:,一{孕一:{只1。。%\lw/(1)式中T:为样品溶液响应值,T初为空白溶液响应值(以蒸馏水为空白).根据毒性物质在不同浓度下的A值,对浓度一毒性响应曲线用经验公式(2)将剂量一响应曲线转化成直线,进行线性回归,用回归方程计算毒物的半有效浓度ECS。值,我们定义T:一ZTw即A一100时毒性物质的浓度为毒物的半有效浓度ECS。值.BC~IC。、11一下;----气共月欺一r一二井入下二一气言七。一七一入力七万(2)式中C为毒物浓度,对某一样品仪器结构~、_~、,~~_口1,_1。,-、,,,、上一声。利万刀苹叭,丁足下二利-不至玫任天杀.七了飞仪器主要由三部分组成,包括主机、光电检测器和预恒温器,光电检测器和预恒温器都被恒温至37士1℃.光电检测器包括光路系统和比色槽,比色槽下有一个磁力搅拌器.主机内包括恒温控制电路,信号放大电路和微机系统,微机系统是以MCS一51单片机为内核,扩展了A/D转换器、字符型LCD显示器、键盘和微型打印机.预恒温器用于样品和细菌悬液的预恒温,光电检测器用于检测亚甲基蓝的浓度变化.光电检测器的放大信号通过微机系统记录亚甲基蓝的退色速度,通过键盘输人毒物相应的浓度,微机系统可以对测量数据进行处理并自动去除可疑值,通过线性回归方程直接计算毒物的EC50值,由打印机输出.主要试剂及测t方法.1液体培养基:1.59牛肉膏(成都生化制品厂),2.59蛋白陈(天津卫生材料厂),2.59抓化钠,1.09葡萄糖,1.329NaHZPO4,0.829KZHPO4,溶