细菌脱氢酶生物试验法检测野外水质毒性的探索_张林

实验技术细菌脱氢酶生物试验法检测野外水质毒性的探索张林孙咏梅林春竹陈翔王军冯建兴①王立世①王燕①(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津,300050)摘要对评价水质毒性,提出了一种新的生物毒性试验方法。其原理是根据水中有毒物质对微生物细胞脱氢酶活性的抑制程度来评估水质毒性大小。应用该方法,测定了水中多种重金属的毒性。结果表明重金属离子Cd2+,Cu2+,Pb2+,Ag+,Zn2+,Hg2+等均对细菌脱氢酶具有较大的抑制作用;将细菌脱氢酶活性的受抑制程度与毒物浓度相关联可求出EC50;lgEC50与传统的生物毒性试验中使用的LC50的对数呈现较好的相关性r=0.8143。微生物脱氢酶生物试验方法用于评价水质毒性,具有快速、灵敏、可靠等特点,是一种具有发展潜力的野外水质综合毒性检测方法。关键词:细菌脱氢酶,水质毒性,重金属,水质评价水质检测传统的化学分析方法在环境检测中起了很重要的作用,能准确定量分析污染物主要成份的含量,但不能直接反映有毒物质联合作用对环境和生态的综合影响。生物毒性试验方法可以直接检测多种有毒物质共存时水质的综合毒性〔1,2〕。近年来国内外一直在致力于生物毒性试验新方法的探索〔3,4〕。本文提出了一种利用细菌脱氢酶活性变化进行环境水质毒性评价的新方法。1材料与方法1.1方法原理生物的呼吸是一系列氧化还原反应过程。某底质在受氢体的存在下,因脱氢酶的作用而被氧化,氢移向其受体,底①南开大学环境科学系质继续氧化。脱氢酶对毒物的作用非常敏感,其活性明显地受到毒物抑制而下降。通过测定酶活性下降程度来评价毒物毒性大小〔5〕。1.2材料实验用毒性物质:氯化镉,硫酸铜,硝酸铅,硝酸银,醋酸锌,硝酸汞,氯化钠,氯化钾,硫酸钠,硝酸钠等,均采用分析纯试剂。菌种为中温杂菌。1.3细菌培养方法培养基:包括牛肉膏0.3%,蛋白胨1.0%,氯化钠0.5%。取菌种,加至90ml培养基中,在37±1℃恒温培养18～20h,其菌体密度为2.5～5.0×108个/ml。上层均匀的悬浊液供实验使用。1.4细菌脱氢酶检测方法取10ml比色·423·1997年第15卷第6期DOI:10.13704/j.cnki.jyyx.1997.06.009皿,加入6ml蒸馏水,2ml菌液和1ml液体石蜡,置于预恒温装置中,放置20min,将比色皿放入经改制的分光光度计中(分光光度计检测池中设置恒温控制)。选择波长620nm,加入0.01%亚甲基兰溶液0.1ml。计时,观察表头指针至满刻度的80%,记录时间。重复操作,作2份蒸馏水平行实验,然后以不同浓度的样品溶液代替蒸馏水,作同样的操作,记录相应样品的时间。2结果与讨论2.1影响毒性试验的因素和实验条件的确定(1)温度:脱氢酶在37℃时具有最大活性,实验中发现温度在37℃±1℃时,实验结果相差不超过10%,可控制在实验误差范围内。(2)溶液pH值:脱氢酶的最大活性时溶液pH值范围在7.2～7.8之间。(3)菌液浓度和稳定度:采用上述方法培养的菌液,其菌悬液在室温8h内保持稳定的活性,可供连续使用。实验中每次测定所需加入菌液的量一般控制在1.0～2.0ml之间,但须保证在空白试验中亚甲基兰的褪色时间控制在15～。25s之间2.2毒物毒性测定及新方法可靠性研究在传统的生物毒性试验(如鱼类毒性试验)中,LC50值(半数致死浓度)是一个普遍采用的指标。EC50值(半数抑制浓度),即在毒性试验中,使实验用指示酶活性下降一半时毒物浓度。它也是生物毒性监测研究中经常使用的毒理学指标。本实验尝试使用该指标表征毒物毒性大小。为了验证毒物对细菌脱氢酶的EC50值表征毒物毒性的科学性和可靠性,我们选择了在传统的生物毒性试验中以鱼类为受试对象所测毒物毒性值(以LC50值表示)作为对照,并对两种方法进行了相关性分析。实验中,对同一种毒物而言,用一系列浓度进行实验,就可得到不同毒物浓度下的细菌脱氢酶活性抑制大小。然后,将脱氢酶活性抑制同毒物浓度相关联,可得出该毒物的EC50值。本实验选择了10种常见无机物质进行实验。实验结果见附表。表中同时列出了文献中鱼类96h半数致死浓度法测定的毒物毒性值〔6〕,作为毒物毒性的参考标附表无机物毒性试验结果化合物NaClNaNO3Na2SO4KClCdCl2EC50(mg/L161210970311172232338202.8LC50(mg/L)----0.2化合物CuSO4Pb(NO3)2AgNO3Zn(CH3COO)2Hg(NO3)2EC50(mg/L)4.11.50.95.60.2LC50(mg/L)0.10.30.030.60.02准值。实验结果显示:重金属离子Cd2+,Cu2+,Pb2+,Ag+,Zn2+,Hg2+等均对细菌脱氢酶具有较大的抑制作用,其抑制能力顺序为:Hg2+>Ag+>Pb2+>C