野外水质快速评价方法的研究_陈翔

野外水质快速评价方法的研究军事医学科学院卫生学环境医学研究所(天津300050)陈翔陈奇洲张林提要用刃天青测定微生物总脱氢酶活性,观察8种毒理学指标控制的毒物:Hg2+、Cd2+、Cr6+、Pb2+、Ba2+、AsO-2、CN-、F-对混合菌及大肠杆菌8099菌株的脱氢酶活性的作用。结果表明:随着毒物浓度的升高,脱氢酶活性受抑制的程度加剧,毒物浓度与脱氢酶活性受抑制的程度有一定的线性关系。并用大肠杆菌8099脱氢酶活性被抑制达50%时的毒物浓度EC50来评价毒物的毒性大小,得到Hg2+、Cd2+、Cr6+、AsO-2、CN-的EC50值分别为1.5、2.9、4.0、16、90mg/L,由此可得毒物毒性大小顺序为Hg2+>Cd2+>Cr6+>CN->AsO-2,与文献通过微生物增殖试验得到的结果基本一致。关键词水质评价刃天青脱氢酶活性在野外条件下对水质进行快速评价一直是个难题,而微生物用于毒物的急性毒性评价具有较多的优点:对毒物反应迅速,易于在实验室操作。微生物拥有高等有机体的大多数生物化学途径,毒物对高等生物代谢的影响在微生物体系中大部分都能体现出来等,因此近年来得到迅速发展〔1〕,是一种有希望的快速评价体系。以微生物进行毒理学实验,采用的指标很多〔2〕,其中酶活性测定属于较简便的方法。在研究环境污染物的毒理学中,脱氢酶活性常作为评价污染物对整体生物毒性的一个指标〔3～5〕。脱氢酶作为生命活动中一类重要的酶,对各类环境污染物相当敏感,具备作为环境污染指示物的条件。因此,我们进行本试验,为研究一种野外水质快速评价方法进行探索。一般地讲,酶反应的速度将随着抑制浓度物的增加而降低。当在低浓度的抑制剂存在时,这种速度的降低与抑制剂的浓度成线性关系。因此,可通过测定酶活性受抑制的程度来评价毒物的浓度大小(生物效应为毒性大小)。1材料与方法1.1试剂作为毒物的氯化汞、硝酸铅、硫酸镉、重铬酸钾、氯化钡、亚砷酸钠、氰化钾、氟化钠均为国产分析纯试剂,刃天青为Sigma公司产品。1.2实验用稀释水为蒸馏水经三级离子交换树脂处理后的去离子水。1.3完全培养基磷酸二氢钾1.64g、磷酸氢二钠2.64g、葡萄糖0.20g、醋酸钠0.20g、牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g,加入去离子水,定容至1000ml,121℃高压消毒15分钟后即可。1.4天然水体混合菌的培养取天然水源水约200ml,冰箱4℃保存,培养前吸取2ml于加有10ml完全培养基的50ml三角瓶中,37℃恒温培养12小时后,再吸取该培养物2ml,加入到有10ml完全培养基的50ml三角瓶中,37℃恒温培养12小时。培养所得的菌液即可作为混合菌母液,保存于4℃。1.5大肠杆菌8099的培养取斜面培养管一支,接种8099大肠杆菌,37℃恒温培养12小时,刮取菌苔,悬浮于1ml灭菌去离子水中,即为大肠杆菌8099菌悬液。按一定比例加入菌悬液和完全培养基,37℃恒温培养12小时,成为实验所用的菌液。1.6刃天青评价法〔6〕取试管6支,各加入混合菌液(或大肠杆菌8099菌悬液)5ml,分别加不同浓度的同一种毒物10ml,避光37℃预温10分钟,加入1.5ml100mg/L刃天青溶液启动反应,t计时为0,迅速吸取2.5ml反应液于有0.1ml1%HgCl2溶液的试管中以终止以应。用UV-1206分光光度计检测其在601nm的吸光度值。t=30分钟时,同样操作。脱氢酶活性(dehydrogenaseactivity)DHA=ΔA601/t。毒物对脱氢酶活性的抑制率:DHAinhibitionrate(%)=(DHA空白-DHA样品)/DHA空白×1002结果与讨论2.1对混合菌脱氢酶的作用低浓度的Hg2+、Cd2+、Cr6+对脱氢酶活性的影响非常显著,而Pb2+、AsO-2、F-、Ba2+、CN-在低浓度下对脱氢酶活性则影响较小。刃天青法重复性较好,而且在实验中将毒物的浓度点设得较多,脱氢酶活性的百分抑制率与毒物浓度的线性关系更为明显,对毒物的毒性评价不仅能够定性,而且可以尝试进行定量(图1)。图1毒物对混合菌脱氢酶活性的影响2.2对大肠杆菌8099脱氢酶的作用实验显示:低浓度的Hg2+、Cd2+、Cr6+对大肠杆菌8099菌株脱氢酶活性表现出很强的抑制作用,随着浓度的升高,AsO-2、CN-对大肠杆菌8099脱氢酶活性也表现出抑制作用,与应用混合菌所得的评价结果51中国公共卫生1999年第15卷第1期基本一致。表明混合菌的脱氢酶活性主要由其中的大肠菌群所贡献,毒物对大肠杆菌8099的影响可以代表毒物对天然水体中混合菌的作用,而且重复性较好,容易标准化。有意思的是,混合菌脱氢酶活性对毒物有更敏感的响应,这可能是由于混合菌存在生存竞争压力的缘故。但对于一种评价方法,标准化更为重要。由于大肠杆菌8099