在pH≤1条件下生存的甲烷氧化菌-氧气微电极

疣微菌门的一个新种：在疣微菌门的一个新种：在pH≤1条件下生存的条件下生存的甲烷氧化菌甲烷氧化菌泥火山、泥沸泉和火山喷气孔是不一般的地质特征，它们会有气体、水和/或半流体泥浆基质1喷出，并且伴随有相当数量的甲烷气体排放到大气中（10-1至103ty-1）2-4。这些区域的环境条件从环境温度、中性pH到高温、低pH都有。虽然有强烈的迹象显示在泥火山有生物学的甲烷消耗4，5，但众所周知没有甲烷氧化菌能在火山喷气孔的恶劣条件（温度高达70℃而pH值低至1.8）下繁茂生长2。甲烷的有氧氧化第一步由可溶性或膜结合的甲烷单氧化酶进行催化。本文报道了pmoA（编码膜结合甲烷单氧化酶的β亚基）克隆库，它们是利用从火山泥沸泉硫质喷气孔和火山喷气孔附近裸土中提取的DNA而获得的，结果显示了新的远缘pmoA基因簇。在50℃和pH2.0条件下对甲烷氧化菌进行富集培养后，与所有已知pmoA基因同源性都不足50%的远缘基因簇在培养菌中得到了表达。最后，我们分离到1株嗜酸甲烷氧化菌AcidimethylosilexfumarolicumSo1V，属于浮霉菌门/疣微菌门/衣原体超门6，“不属于”包括已定名甲烷氧化菌在内的α-和γ-变形菌亚门。这种细菌生长在氧气受限条件下，以甲烷作为唯一能源，pH值可低至0.8——远低于曾报道过的甲烷氧化菌最佳pH值。A.fumarolicumSo1V有3种不同的pmoA基因，其中2种与泥沸泉处菌样的基因序列非常相似。源自美国黄石公园环境高度相似的16SrRNA基因序列表明：这种新型甲烷氧化菌可能是极端环境中的常见菌种。本文首次报道了分布广泛的疣微菌门中的代表菌与地球化学反应有关，而大部分疣微菌仍未分离鉴定6。生产于地球地壳的大量地质甲烷一般自然地释放到大气中3,7,8。甲烷释放的初步地球评估显示应该有足够量的甲烷资源来解释全球甲烷失踪8。最近的HaakonMosby和Carpatian泥火山研究结果表明，这些系统可能也是这些地质甲烷的汇4,5,9。在这些温和环境条件地区（2-25℃和中性pH值），好氧和厌氧甲烷氧化菌中16SrRNA基因都存在。相反，那些例如位于那不勒斯附近波佐利（意大利南部）的硫质喷气孔的喷气孔处，也排放的大量甲烷（73吨甲烷每km2每年）2，它们土壤的特点是pH值低（低至1.0）且温度不断升高（高至70℃）。这些地方富含硫化氢这种亚硫气体，其被微生物氧化成硫酸，从而造成了极度的酸性环境。硫质喷气孔的极度酸性土壤支持大量的甲烷消耗2，但迄今为止仍不知道可能是微生物造成这一消耗。假设绝对好氧甲烷氧化菌是一组独特的细菌组，无论是属于变形菌门α或γ亚纲，它们均使用甲烷作为唯一的能量和碳源来源10。到目前为止，除报道Methylocellasp.是唯一含有可溶性细胞质形式的MMO（sMMO）外11，已证明其他所有好氧甲烷氧化菌均包含一类膜结合微粒甲烷单氧化酶（pMMO）。pmoA基因（编码膜结合MMO的24kDa的β-亚基12）通常作为甲烷氧化菌系统进化的标志。甲烷氧化菌广泛分别于自然环境中，并大多嗜中性和嗜温。但是，在分子研究的基础上，过去十年中极端变形甲烷氧化菌的分离和鉴定仍是刚刚开始13。迄今为止，从酸沼中分离细菌的报告仍然支持最低pH值下甲烷氧化菌仍具活性的事实11,14,15。这些细菌属于变形菌纲α亚纲（Methylocella，Methylocapsa和Methylocystis），并显示它们生长的pH在4.2和7.5之间，且在pH5.0左右甲烷氧化酶活性最大。硫质喷气孔的内部，具有中央泥池（fangaia）周围充满裸露的酸性土壤（pH值1-2）的特点，那里是取样并提取DNA并开始对pmoA基因进行分子研究的地方。本文中构建存在于这种环境下的pmoA基因克隆库，需使用这种DNA为模板进行聚合酶链反应，其中pmoA引物为A189/A682（参见16），这样才能够广泛应用，也可扩增铵基单-氧化酶B亚基（amoA）的基因。我们只能使用非限制性条件（退火温度从56℃降低至48℃；无假阳性克隆获得）扩增pmoA基因，需指出的是存在的pmoA基因与已知序列一致性低。pmoA序列的系统发育分析支持这种观点，并显示硫质喷气孔pmoA序列组分成两个组：一组代表着一枝全新的，pmoA/amoA进化系统树中的深枝，它们与已知序列同源性非常低（图1）；另一组是γ变形甲烷氧化菌。图1.推论的推论的PmoA和AmoA蛋白间的亲缘关系蛋白间的亲缘关系。由PAMDayhoff矩阵计算出来的邻接树如图所示，分枝中用到了500个重复样品值作为引导指令值。那个条代表了50％的估计序列散度。应用不同的方法编排树发现树拓扑结构一致。FangaiaPmo和土壤Pmoprefix分别是指从泥温泉中心和裸露酸土样本中提取DNA进行的环境克隆。富集是指