高效液相色谱法3

第七节定性、定量分析方法及应用与示例一、定性分析方法HPLC的定性方法可为色谱及非色谱鉴定法两类。1.色谱鉴定法利用纯物质和样品的保留时间或相对保留时间相互对照，进行定性分析，方法虽简单粗糙，但仍是已知范围未知物常用的鉴定方法。2.化学鉴定法利用专属性化学反应对分离后收集的组分定性。由于用HPLC收集组分比GC容易，因此该法是较实用的方法之一。官能团鉴定试剂与气相色谱的官能团试剂相同。3.结合色谱分离与质谱或光谱的鉴定法(1)离线色谱分离质谱或光谱鉴定方法：把HPLC作为分离手段，制备纯组分，而后用光谱仪器鉴定。要求分离度足够大。IR与MS需样量约1mg，NMR需样量较大，一般需3mg以上，太少需增加累加次数。(2)联用仪将高效液相色谱仪与光谱仪(或质谱仪)用界面联接成一个完整仪器，实现在线检测，称为联用仪。两谱联用仪能给出样品的色谱图，并能快速给出每个色谱组分的光谱(或质谱)图，能同时获得定性、定量信息。是当今成分复杂样品分析、鉴定的最重要手段。最常见的是HPLCUV联用仪，它能给出HPLCDADUV三维谱，但定性效果一般。HPLCMS联用仪是当前天然药物成分、药理与临床研究的最重要的联用仪器，但接口技术是关键，电喷雾界面是当前较理想的接口。大气压化学电离离子源，也是HPLCMS联用仪常用的离子源。二、定量分析方法液相色谱法的定量方法与气相色谱法相同。在液相色谱分析中，较少使用校正归一化法。常用外标法及内标对比法等进行定量分析。1.外标法以待测组分的纯品作对照物质，对比求算试样含量的方法。外标法可分为•外标工作曲线法•外标一点法•外标二点法等。优点：不需要知道校正因子，只要被测组分出峰、无干扰、保留时间适宜，就可进行定量分析。缺点：进样量必须准确，否则定量误差大。在HPLC中，因进样量较大(l0ml或以上)，而且用六通阀定量进样，进样量误差相对较小，因此外标法是HPLC常用定量方法之一。外标工作曲线法，常是用于检验线性范围及工作曲线是否通过原点。因为只有截距为零时，才能用外标一点法定量。在药物分析中，为了减小实验条件波动影响分析结果，采用随行外标一点法。即每次测定，都同时进对照品与样品溶液。2.内标法内标法分为工作曲线法内标一点法内标二点法内标对比法校正因子法在HPLC中最常用内标对比法。选择内标物的三个条件(纯、样品中不含有、保留时间接近)，在HPLC中的要求与GC完全一致。一般可选择一个化学结构与待测物质相似、物理性质相近的纯物质作为内标物，加到待测样品溶液中，经过样品前处理后进样。使用内标法可抵消因仪器稳定性差、进样量不够准确等原因带来的实验误差。(1)内标对比法：这种方法不需知校正因子又具有内标法的定量准确度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分析结果(含量)常用标示量％表示:(21.13)式中(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液中的量，W为平均片重(或丸重等)，m是取样量，其它符号的含义同GC章。若试样溶液与对照溶液中加人内标物的量相等，所称取的样品重与平均片重相同，则上式的后二项均等于1。%100//%mWmmAAAAsssisi对照样品对照样品标示量测定实例测定实例复方乙酸水杨酸片剂的含量测定(图21－17)。实验条件略对照溶液的配制按药典APC片剂处方(一片量)，精密称取阿司匹林(A)、非那西丁(P)、咖啡因(C)及扑热息痛(内标物)的对照品0.220、0.150、0.035及0.035g(ms)，放入100ml容量瓶中，用乙醇一氯仿(1:l)溶解，并稀释至刻度，备用。样品溶液(供试品溶液)的配制取5～10片的复方APC片剂，精密称定，求出平均片重W。将片剂研成细粉，取一片量的细粉，精密称定为m克。将此细粉用乙醇一氯仿(1:1)多次提取，过滤、滤液转移至100ml容量瓶(瓶内已放入精密称取的扑热息痛0.035g)中，洗涤沉淀，将洗涤液与滤液合并，稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液，备用。