荧光原位杂交技术在动物肠道微生物定量中的应用-奚晓琦

荧光原位杂交技术在动物肠道微生物定量中的应用奚晓琦1,2,王加启1,邓露芳1,李旦1,卜登攀1,魏宏阳1(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室,北京100193;2.东北农业大学,哈尔滨150030)摘要:以16SrRNA为靶序列的寡核苷酸探针荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization,FISH)已广泛应用于分析环境中复杂的微生物群落构成。作者简要介绍了荧光原位杂交技术的原理和操作方法,对其在动物肠道中微生物鉴定和计数上的应用进行了概述,最后探讨了FISH技术的局限性及其应用前景。关键词:荧光原位杂交;16SrRNA寡核苷酸探针;肠道微生物中图分类号:Q93-3文献标识码:A文章编号:1671-7236(2008)12-0053-03研究结果证明,哺乳动物肠道内的微生物与宿主健康有着极为密切的关系(VLKOV等,2006),因此,对动物肠道中微生物的多样性和微生物种群之间的相互作用加以准确分析具有重要意义。但由于动物肠道内微生物群落复杂而且数量庞大,导致应用传统方法很难准确定量(Chierici等,2003)。传统方法研究动物肠道中微生物群落结构一直建立在分离和培养的基础之上,这种方法有两大缺陷,一是胃肠道有些细菌很难或不能通过培养基培养存活;二是以前认为的特异性培养基只是相对特异,用这种培养基对某种细菌计数并不准确(Amannri等,1995;Rossello-Morar等,2001)。用传统培养方法所得出的研究结果不能准确反映肠道微生物群落的组成和生态演替情况。因此,建立和发展一种不依赖微生物培养的方法来监测微生物群的变化是非常有必要的。20世纪80年代末,分子生物学技术开始广泛应用于动物胃肠道微生物群落结构分析,而且发展迅速,研究焦点集中在微生物保守序列的16SrRNA上,尤其是微卫星SSR(simplesequencerepeats,SSR)、内部简单重复序列(inter-simplese-quencerepeat,ISSR)、扩增片段长度多态性(am-plifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)、随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、单链构象多态性(single-strand修回日期:2008-11-24作者简介:奚晓琦(1983-),女,内蒙古人,硕士生,研究方向:反刍动物营养。通讯作者:王加启(1967-),男,安徽人,博导,从事刍动物营养与牛奶品质改良研究。基金项目:动物营养学国家实验室自主研究课题(2004DA25184(团)0801);“十一五”奶业科技支撑项目(2006BAD04A03)。conformationpolymorphism,SSCP)和变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)等方法的应用,不断为研究微生物种群和鉴定微生物提供新的途径。但是,这些基于PCR的方法可能会在扩增反应中引入误差,降低所得信息的精确度。荧光原位杂交技术作为一种不依赖PCR的分子分析技术,是对上述各种分子标记技术存在缺陷的有益补充,其主要特点是结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性,能够同时提供关于微生物形态、数量、空间分布与细胞环境方面的信息(Choi等,1994),使人们可以在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体,并对微生物群落进行评价(Raap等,1998)。1荧光原位杂交的原理荧光原位杂交技术是采用荧光染料标记的、以微生物的核糖体小亚基为靶标的寡核苷酸探针,与固定好的微生物样品进行原位杂交,将未杂交的荧光探针洗去后用荧光显微镜进行观察和摄像,对微生物类群进行原位分析和空间位置示标(张彤等,2003)。荧光原位杂交技术检测微生物样品的操作主要包括以下步骤(Delong等,1989):用多聚甲醛将微生物细胞固定;将固定好的细胞固定在明胶包被过的载玻片上,用梯度浓度乙醇脱水;在杂交温度下,用探针进行杂交;清洗多余探针;用4,6-联脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidimo-2-phenyhndole,DAPI)复染;将样品封片,利用荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜进行观察。2荧光原位杂交技术在肠道微生物定量中的应用2.1定量双歧杆菌双歧杆菌作为动物胃肠道中的优势菌之一,在复杂的微生态环境中与近400种其他肠道菌形成栖生、偏生、共生、竞争或吞噬等复杂关系,在促进宿主生长、维护和提高宿主免疫、生·53·中国畜牧兽医2008年第35卷第12期生物技术物颉颃及稳定宿主胃肠道的微生态环境等方面起着重要的作用(Yamazaki等,1985;Suskovie等,2001)。Langendijk等(1995