海南生态区植物根际解磷细菌的筛选及分子鉴定

液中,用相同的培养条件进行培养,并测定解磷量和培养液的pH值。115解磷活性的数据分析解磷活性的数据用Excel2000初步处理后,采用SAS6112统计软件及Duncanπs全复矩法进行方差分析和多重比较。116菌属初步鉴定按文献[8]提取PSBHS的基因组DNA,用简并引物(fD:5’2CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCMTGGCTYAG23’,rP:5’2CCCGGGATCCAAGCTTACGGHTACCTTGTTACGACTT23’,其中M=A或C;Y=C或T;H=A或T或C)扩增16SrDNA基因一个长度约1460bp的基因片段,克隆、测序后,通过Blast检索公共序列数据库上的同源序列,根据最相似同源序列的菌株来源鉴定PSBHS的分类。2结果和分析211细菌分离和代表菌的选取用NA、NAC、YEM3种培养基分离28个根际土样品的细菌,获得363个代表性菌株。其中从5个橡胶树根际土样品获得60个代表性菌株,从4个桉树根际土样品中获得46个代表性菌株,从台湾相思树、香蕉、毛竹、茅草、结缕草的根际土样品中获得47个代表性菌株,从14种红树林植物的根际土样品获得210个代表性菌株。212筛选将363个代表性菌株接种到Ca2P固体培养基上经32℃培养5d,有126个菌株产生明显的溶磷圈(如图12A中的3个菌株),135个菌株虽能缓慢生长但无明显的溶磷圈(如图12B中的DR350和DR363),而其余菌株则不能生长。用Ca2P培养液对具溶磷圈的126个PSB进行32℃、200rΠmin培养6d,筛选出45个解磷量>20010mgΠL(不接菌的对照培养液含磷1812mgΠL)的PSB。将45个PSB进行连续4次循环的继代培养———保藏过程,再将其斜面保存物接入Ca2P培养液中培养6d,发现有31个PSB解磷能力不稳定,在继代培养和4℃保藏过程中逐渐丧失解磷能力,有14个PSB解磷量大于20010mgΠL(表1),其中DR379菌株的解磷量最大,达62613mgΠL。14个PSBHS经6d培养,Ca2P培养液的pH值降至3182～4134(对照液pH值6183)。培养液pH值(X)与菌株解磷量(Y)的相关系数r=-018155,图1代表性菌株解磷活性的Ca2P固体平板测定Fig.1Phosphate2solubilizingcapabilitytestsforbacterialrepresentativestrainswereconductedonsolidmediumwithtricalciumphosphateasthesolePsource.Halozonessurroundingthecoloniesindicatedcorrespondingstrainswithphosphate2solubilizingactivities.表1高效稳定解磷菌株经6d培养对Ca3(PO4)2的解磷量及培养后培养液的pH值a)Table1AmountsofphosphorusdissolvedfromCa3(PO4)2byPSBHSafterliquidcultivationfor6daysandtheresultingpHvaluesofmediaa)Strainnumberofphosphate2solubilizingbacteriaAmountofdissolvedphosphorusΠ(mgΠL)pHvalueofculturemediumDR37962613±8.4a3182±0.08fDR24453218±44.0b4103±0.06eBR09842812±32.6c4105±0.02eBR11537411±19.0c4101±0.03eBR12135712±73.1cd4116±0.02cdAR04535611±43.3de4103±0.06eDR17234211±18.5de4102±0.04eBR11931410±56.9de4110±0.02deDR30430710±32.7de4102±0.05eAR06629211±18.6ef4125±0.07abcCR15029111±11.1fg4122±0.04bcBR12628812±103.2de4134±0.05aDR20623818±21.7fg4126±0.04abCR14220110±21.8g4129±0.02abNon2inoculatedmedium1812±3.4b)6183±0.04a)Dataareshowedasmean±Std.,andthelettersappendedshowthemultiplecomparisonresultsfordifferentmeans.Meanswiththesameletteraren