海绵共附生微生物基因多态性的RAPD-PCR分析

海绵共附生微生物基因多态性的RAPD．PCR分析李志勇，秦思昊，何丽明，黄艳琴(上海交通大学生命科学技术学院海洋生物技术实验室，上海200240)摘要：采用传统分离手段对中国南海海域的细薄星芒海绵(SteHeaatenui(LindBren，1897)1、皱皮软海绵(Halichondriarugosa(Ridley&Dendy))、澳大利亚厚皮海绵(Craniellaaustraliensis(Carter))、贪婪倔海绵(Dysideaavara(Schmidt))4种海绵体内的微生物进行了分离培养，随机挑选64株芽孢杆菌属细菌(每种海绵16株)进行了RAPD．PCR基因多态性分析。研究表明，一些海绵微生物是可以通过传统分离手段得到的，来自同一或者不同海绵的微生物均具有丰富的基因多态性。关键词：海绵；芽孢杆菌；RAPD．PCR；聚类分析中图分类号：Q93文献标识码：A文章编号：1000-3O96(2o06)O7-o015-O6海绵以其独特的腔状结构和依靠过滤海水而获得营养的方式使其成为海洋微生物良好的宿丰II1。大量研究证实海绵化合物具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、扩张心血管、增强免疫力、酶抑制、抑制细胞分裂等功卜。自从1995年以来，从海绵中分离到的活性物质与从其他所有海洋生物中发现的活性物质相当，海绵也因此而成为许多国家开发海洋新药研究的热点。目前海洋活性物质来源已经成为限制海洋药物开发的瓶颈问题。一些国外的研究表明，海绵的活性物质可能来自于其体内的微生物[8~10】，使海绵微生物研究显得更为重要和迫切，其中海绵体内丰富微生物多样性的揭示是最基础的科学问题。2O世纪8O年代以来，中国已经针对海绵的化学成分、活性进行了比较多的研究【”。2002年国内开始进行海绵微生物的研究，但在海绵微生物多样性揭示方面的研究非常欠缺，有待开展。分子技术在微生物多样性的揭示方面已显示了传统的生理、生化和形态学研究方法不具有的优势。其中，随机扩增的多态性分析(RAPD：RandomAmplifiedPolymorphicDNA)可以在对对象基因信息没有任何了解的前提下运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记而初步揭示不同菌落的分类关系【】，非常适合复杂的海绵微生物多样性研究。作者首先采用传统的微生物分离纯化手段对中国4种南海海绵进行微生物分离培养，利用RAPD．PCR基因多态性技术对64株芽孢杆菌的基因多样性进行研究，目的是从基因水平对中国南海海绵的微生物多样性进行初步揭示，为结合其他手段(例如PCR．DGGE、FISH、透射电子显微镜)全面了解海绵共附生微生物多样性信息奠定基础。l材料与方法1．1海绵样品采集自中国海南周边5～2Om海域，经中国科学院海洋研究所李锦和研究员鉴定为：细薄星芒海绵SteHettatenui(Lindgren，1897)、皱皮软海绵Halichondriarugosa(Ridley&Dendy)、澳大利亚厚皮海绵Craniellaaustraliensis(Carter)、贪婪掘海绵Dysideaavara(Schmidt)。收稿日期：2003．10-10；修回日期：2004．02．10基金项目：国家863计划资助项目(2002AA628080。2004AA628060)；上海市科技启明星资助项目(04QMXI411)作者简介：李志勇(1969．)，男(回族)。河南信阳人，教授。博士，主要从事海绵共附生微生物方面的研究，电话：021-34204036~E—mail：zyli@sjtu．edu．caMarineSciences／Vo1．30，No．7／200615维普资讯http://www.cqvip.com1．2海绵微生物的分离无菌条件下用无菌水冲洗掉海绵表面附生的微生物，剖开海绵从内部切取海绵小块并切成1mm的碎块，直接在FL培养基和C．mix培养基[14J平板上划线，置于生化培养箱20℃培养1周，挑取单菌落。同时，将上面获得的海绵碎块置于装有50mL无菌人工海水【l5J的锥形瓶中20℃彻底分散使体内微生物释放出来，取10～，1O～，10一，10，10～，10，10～，10。稀释液O．5mL分别在FL培养基平板上涂布，20℃培养1周，挑取单菌落。将以上两种方法得到的单菌落连续两次划线得到纯化的菌株，平板4℃保存。从分离到的微生物中选择芽孢杆菌属细菌，随机挑选64株进行RAPD．PCR分析基因多态性。菌株编号方法如下：以海绵拉丁文名称第一个字母置前、阿拉伯数字居后方式进行菌株编号，例如S1表示从细薄星芒海绵中分离到的1号菌株。1．3基因组DNA的提取将单菌落接种至含5mL的FL液体培养基的试管中，20℃培养1周。取3mL菌液，10000r／min离心5min，弃去上清液。沉淀用1．5mLTE缓冲液重新悬浮，l