琼脂糖凝胶电泳的条件优化——质粒DNA重组片段的限制性内切酶谱鉴定 (1)

齐齐哈尔医学院学报2011年第32卷第1期琼脂糖凝胶电泳的条件优化——质粒DNA重组片段的限制性内切酶谱鉴定曹秀华王亚婷李丽郭芳汪晶冰张博李艳丽寇晓因李剑华随着质粒构建，转染，扩增等基因表达相关的分子生物学技术在科研中的广泛开展，DNA的琼脂糖凝胶电泳技术由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定生物大分子(核酸)的重要手段和常用方法。影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素很多，包括DNA分子大小和构象，琼脂糖浓度，所加电压，电泳缓冲液的离子浓度，嵌人染料一溴化乙锭(EB)的存在等[13。只有使用最合理的条件组合，才能缩短实验进程，避免重复操作，获得清晰准确的电泳图谱，达到鉴定分析质粒片段的目的。我国的科研资源有限，为节省人力，物力，财力，使限定的投入获得最大的收效；有效利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量、分子量，及分离不同大小DNA片段(切胶取带，纯化特异长度的DNA片段)，探索优化的电泳条件，十分必要。本文在科研工作中针对酶切后片段电泳的琼脂糖浓度，电压、荧光染料的使用等常用重要条件进行对比优化，总结如下。1材料和方法1．1材料经限制性核酸内切酶(HindNI、Notl、EcoRI、EcoRV等，TaKaRa)水解的质粒，含有不同分子量的DNA片段的样品。核酸处理：2Ol酶切体系中含适当的缓冲液，100～20Ong定量稀释的待鉴定重组质粒，37。孵箱酶切消化3小时或过夜。1．2仪器设备水平板电泳槽(13cm×12cm×2．5cm，含有约200mlTBE×1缓冲液)；电泳仪POWERPAC300(B10RAD，美国)；台式高速离心机；紫外荧光成像系统(Ultra—VioletProductUVP，英国)；热敏打印纸(UPP一11OHG，SONY)；微量移液器(GILS0N，France)及微量吸样头tips；微波炉；灌胶模具(5cm×6cm×0．6cm凝胶体积)及梳齿(O．5crux0．5cm×0．1cm)；一次性手套；灭菌Eppendorf管}锥形瓶；核酸浓度检测用紫外分光光度计DU一640(BECKMAN，uSA)；电热恒温培养箱(XMT一152A，宁波)。1．3主要试剂pH8．3Tris一硼酸一EDTA缓冲液：称取1O．78gTris，5．5g硼酸，0．930gEDTA—Na2溶于无离子水，定容到100ml，配制成浓缩母液，用时稀释10倍，EB溶液：10Oml水中加入溴化乙锭干粉1g，磁力搅拌数小时至溶解。将配好的10mg／ml溶液装在棕色瓶中，室温避光保存，作者单位：齐齐哈尔医学院附属大庆油田总医院临床检验中心(曹秀华、王亚婷、汪晶冰、李艳丽、寇晓囡、李剑华)大庆油田总医院呼吸内科(李丽)上海市宝山区高境社区卫生服务中心口腔科(郭芳)黑龙江省伊春市伊春区二中校医室(张博)第一。第二及第三作者对本文有相同贡献通讯作者：王亚婷，E—mail：yating~ang_2007@yahoo．COIn．cn邮编163001收稿日期2010—12—04·9·使用时稀释至终浓度0．5~g／ml；浓缩的6×上样缓冲液LoadingBuffer：50甘油或蔗糖水液+O．25溴酚蓝(TaKa—Ra)；琼脂糖(SeaKemLEAgarose，Lonza，USA)；DNA分子量标准Marker(特定长度的核酸片段的标准品，TaKaRa)包括XHindIlI、100bpDNALadderMarker、1kbMarker稀释和调整核酸浓度用的TE缓冲液(pH一8)。2结果与分析2．1不同构象DNA分子在高或低浓度琼脂糖凝胶中的迁移情况比较经超速离心纯化的重组质粒DNA分子存在3种构象：超螺旋闭环DNA(I)、直线DNA(Ⅱ)、开环有缺口的双链环状DNA(HI)。在特定的较低琼脂糖浓度中I比Ⅱ型迁移的更快，因为I型可以扭曲蠕行快速通过较大的凝胶孔径。在高浓度的凝胶中，顺序可能颠倒，由于超螺旋DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为较低，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进]，因此，质粒的这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，如图1。如果是酶切后线状化的DNA分子(Ⅱ型)，则其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度存在线性关系。分子越大迁移越慢，DNA分子的迁移率与其碱基数的常用对数成反比，分离小于0．4kb的DNA片段时凝胶浓度通常为1。2～1．5，分离大于8kb的DNA分子所需胶浓度为0．3～0．7，DNA片段大小位于两者之间则所需胶浓度为0．8—1．0，如图1，2，5。O．佰Gelt．麟Ge1图1质粒相同状态下电泳情况图1左右两块胶在同一电泳槽中，酶切后的质粒以相同条件(加入同量DNA和标准品，并且泳动相同时间，制胶缓冲液和电泳液为相同批次制备)左侧为0．7％浓度的琼