土壤样品的收集方法

一宏基因组样品的收集、提取和纯化方法1.1.土壤样品的收集方法：土壤样品的收集方法：开始采样，去除表面浮土，使用乙醇火烧的铲子挖取地下5至20厘米的土层，去除可见根后，土壤过2毫米筛网，每个样品从3个采样点采集并混合而成，其中样品量为50g，将采集的土壤样品保存于无菌离心管中，置于0℃以下，待样品采集完毕后，运回实验室，用于抽提DNA，如不能马上实验，请将土壤样品迅速冻存于-20℃冰箱。土壤样品DNA提取方法：见文章C.D.Clegg,K.RitzandB.S.Griffiths.(1997).DirectextractionofmicrobialcommunityDNAfromhumifieduplandsoils.LettersinAppliedMicrobiology;25,30–33.此篇文献中，从腐殖化土壤中提取得到了高产量高纯度的微生物DNA，每g干土最高DNA产量达30ug，OD260/280，OD260/230值介于1.6-2.0。其大致提取纯化流程为：溶解酵素处理——SDS处理并反复冻融裂解——沉淀——氯化铯密度梯度离心。土壤样品提取步骤为：1)每1g样品，加入200mg的酸洗的聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpoly-pyrrolidone(PVPP,Holbenetal.1988)并混匀2)加入3mL含30mg溶解酵素(Sigma)的裂解液（0.15mol/LNaCl;0.1mol/LNa2EDTA;pH7.0），充分混匀，然后37℃温浴1-2h3)加入200uL浓度为23%的SDS溶液，50℃温浴30min，然后放置-80℃冰箱，然后从冰箱取出样品，50℃温浴10-15min，重复此冻-融过程2次4)离心（10500g，10min，10℃），取上清5)用2mL裂解液重悬沉淀，剧烈振荡至均匀，离心（10500g，10min，10℃），取上清6)合并上清，加入等体积的酚氯仿异戊醇溶液（酚：氯仿：异戊醇=24:24:1），混匀，涡旋振荡，然后离心（10500g，10min，10℃），回收水相（含DNA）7)将水相中加入5mol/L的NaCl溶液，使其终浓度为0.2mol/L。然后加入等体积的异丙醇。8)混合液室温静置至少1h（或4℃过夜放置），然后离心（10500g，20min，10℃），保留沉淀9)沉淀用70%的冰乙醇洗涤2次，然后自然风干10)用TE溶液(10mmol/LTris–Cl,pH8·0;1mmol/LEDTA,pH8·0)重悬沉淀，即为微生物DNA溶液2.微生物微生物DNA纯化步骤为：纯化步骤为：1)用TE溶液（pH8.0）将DNA样品定容至2.55mL，加入2.55gCsCl和25uL氯乙啡啶（10mg/mL），然后超离（150000g，16h，离心机：BeckmanTL-100，转头：TLA100.3）2)从超离管中用注射器吸出含DNA的条带（注意：动作需轻缓，不要吸出杂质），用Microcon30微型浓缩器(Amicon,UK)浓缩样品，并用TE溶液（pH8.0）洗涤数次3)根据操作指南收集DNA样品，再用50uLTE溶液（pH8.0）洗涤一次，再次将悬液定容至2.55mL，加入2.55gCsCl和25uL氯乙啡啶（10mg/mL），然后超离（150000g，16h，离心机：BeckmanTL-100，转头：TLA100.3）4)浓缩，最后乙醇沉淀样品，并用200uL去离子水溶解DNA样品二、宏转录组样品的收集、提取和纯化方法1、土壤样品的RNA提取参考文献：KenC.McGrath,SkyeR.Thomas-Hall,etal.(2008).IsolationandanalysisofmRNAfromenvironmentalmicrobialcommunities.JournalofMicrobiologicalMethods;75:172–176.堆肥、花园耕土的RNA提取：1)挑取20g土壤于50mL的管子内，加入20mL无菌水（(Milli-Q)），振荡20-30S，直至形成悬浮液2)静置10S，待大颗粒物下沉，将上清液吸取到另一管子（2mL）内，离心（14,000g，2min），丢弃上清，沉淀-80℃留存待用3)采用PowerSoil™RNAextractionkit(MoBio,USA)提取RNAmRNA的分离：的分离：1)采用RNaseaway™(Invitrogen,Australia)试剂盒避免RNase的干扰，所有的溶液枪头等均需进行DEPC处理2)将总RNA样品凝胶（1.5%WizardSV凝胶）电泳（100V，45min，电泳液：1×TAEbuffer（40mMTrisbase;20mMaceticacid;1mMEDTA；pH8.0）3)23S,16S,5