利用FISH直接检测环境微生物技术

第七次全国环境微生物学术研讨会论文摘要利用FISH直接检测环境微生物技术程瑶李永峰陈瑛。(哈尔滨工业大学市政环境工程学院，哈尔滨150090)1．引言诊断微生物学的最终目的是迅速，灵敏鉴定自然界的细菌。基于培养的方法耗时，而且经常会遇到不能培养的细菌．近些年，分子技术，如PCR产物杂交或测序己用于微生物的所有领域进行灵敏检测，细菌的鉴定也成为可能。但是，这些方法不能提供微生物的形态学，数量，空间分布或细胞环境。相比之下，FISH与分子遗传学结合，进行微观信息的显示。可进行自然界微小环境个体微生物细胞的显色和鉴定．1989年，Delong第一次用荧光标记的寡核苷酸检测一个微生物细胞．与放射性探针相比，荧光染色更为安全，结果更好，不需增加步骤。而且，荧光探针发射不同波长，这样一个杂交步骤可检测到几个目的序列。过去十年，FISH以敏感，迅速，作为一个强有力的工具用于微生物学系统发育学、形态学、诊断和环境研究。2FISH操作程序FISH通过荧光探针检测核酸系列，荧光探针与整合的细胞中互补的目的序列特异结合。包括五步：(i)固定样本；(ii)样本制备，可能包括特异预处理；(iii)用相应的探针检测目的序列：(iv)洗脱，去掉未结合的探针。(vi)加衬托物，显示。结果整理。2．1探针和标记FISH的探针选择需考虑特异性，灵敏度，细胞易透性。典型的核苷酸探针长度15—30bp之间，可自动合成．短的探针易进入目的物，但含有标记物也少。直接荧光标记是常用的方法，也是最快最便宜最简单的方法。杂交后不需要进一步的检测。很多个荧光染料分子直接结合在寡核苷酸上，合成过程中，用末端转移酶将探针的5’末端或酶连接到3’末端的荧光标记核苷酸。通过18个碳隔离物的FITC结合到寡核苷酸的比直接配对的探针可能增强信号强度。2个末端都加标记的探针可增强荧光信号，3’末端加一个荧光分子，5’末端加4个荧光分子，用适当的隔离物防止荧光色素弯曲。荧光标记的寡核苷酸可购买。可在一20C中储存几个月。有时，直接检测是有用的，FISH序列的灵敏度可通过连接探针到报告分子。如DIG，然后用荧光抗体检测．FISH的灵敏度可进一步用酶的信号扩大来增强。DIG标记的寡核苷酸可通过抗DIG的抗体核碱性磷酸酶来检测。碱性磷酸酶将HNPP磷酸化，与FastRedTR结合使用时产生亮红色。据报道，这种荧光色素比只有一个标记的寡核苷酸的荧光敏感度高8倍。酶信号扩增的方法由TSA系统进一步改进。寡核苷酸用HRP标记，用荧光素．酪胺作底物．TSA系统1个信号强度增10一20～fold．但是，阳性细胞的数目相对单标记探针的传统方法明显减少．可能是因为高分子量制剂渗入到细菌细胞的量不足。虽然，通过溶菌酶透性增强了信号强度，但这种方法似乎不第七次全国环境截生物学术研讨会论文摘要适于革兰氏阳性种类，所以可用于许多混合细菌群落的分析。自然界样本的FISH的灵敏度用几种荧光物分子标记的多聚核糖核苷酶显著增强。大多数敏感度高的方法可能都结合了DIG和TSA系统。2。2荧光染色不同激发量和发射量的荧光物，可同时检测到2种或更多种微生物。为同时显微观察多种颜色的FISH。可用于多带通过的虑膜。混合的荧色物应该有发射高峰，防止形成2种探针的交迭，同时去背景渗出问题。最亮显色最稳定的应用于低丰度的微生物。最常用于FISH的染液是荧光素(FITC，Fluox)，若丹明衍生物(TRITC)，目前，更多的是花青，如Cy3和Cy5(表1)。花青比经典染料好，因为花青通过更高的染色，光漂白时又非常稳定，兰荧光对染用于芳香族化合物二胺，如DAPI，与DNA具很大亲和性，而非特异结合。表l：检测微生物的FISH方法中的常用荧光标记物2．3rRNAFISH标记靶微生物学中最常用的FISH的目的分子的是16SrRNA，因为16SrRNA具有遗传稳定性，保守区和可交区的主要结构，高的拷贝数。细菌和古细菌的每个分类单元种属特异性，可根据目的rI斟A基因提供了更简单，精确鉴定大多数微生物的方法。这在处理混合的微生物群落或未培养的生命体时极其重要。每个复制和新陈代谢活跃的细胞中16SrRNA的高拷贝数。通常，提供了足够的标记靶。可见单一细菌细胞，甚至是FISH中单标记的寡核苷酸。标记靶位点的选择和探针的设计应极度小心。有很多相应的软件用于设计探针，如ARB软件包。16SrDNA、rRNA、18SrDNA和mRNA已经成功进行FISH检测。2．4固定杂交之前，细菌必须固定，渗入荧光探针到细胞中，使RNA不被外源RNA固定需用特定的制剂，如乙醇或甲醇，或交联试剂，如醛以及混合物。固第七次全国环境微生物学术研讨会论文摘要定条件依预固定的微生物样本差异而不同。有效的固定剂对可产生好的FISH结果，但是很难优化。最理想的固定剂应使探针易渗入，目的RNA的