沼气发酵微生物区系变化及产甲烷古菌群落结构分析

中国农业科学院硕士学位论文沼气发酵微生物区系变化及产甲烷古菌群落结构分析姓名：王刘阳申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：胡国全20080601摘要准确、全面地了解沼气发酵池中微生物群落，尤其是产甲烷古菌群落的结构和变化规律，能为沼气发酵过程优化设计、沼气发酵微生物的代谢调控和沼气发酵菌剂的开发等提供系统的微生物学基础参数。本文综合应用传统微生物学、现代分子生态学和分子生物学技术，采用MPN(mostprobablenumber)计数分析以及基于PCR的16SrDNA克隆文库分析和DGGE(denatufinggradientgelelectrophoresis)指纹图谱分析等研究方法，对沼气发酵池中微生物群落区系的多样性及其变化规律和其中产甲烷古菌群落结构进行分析。经MPN计数分析，两口正常沼气池中发酵性细菌为9．5x107个／mL和2．5x106个／mL，厌氧纤维素分解菌均为9．5x10个／mL，产甲烷古菌为4．5x106个／mL和2．5x107个／mL，硫酸盐还原菌为4．5x105个／mL和1．5xlo个／mL。经克隆文库分析，沼气池中细菌以未培养细菌(unculturedbacteria)为主，还有梭菌目(clostridiales)、互养菌属(syntrophus)和Y一变形菌纲(gammaproteobacterium)细菌等类群，部分序列与GenBank中所公布序列的相似性较低(<95％)；古菌全是产甲烷古菌，以甲烷粒菌属(methanocorpusculum)为主，其他类群包括甲烷袋状菌属(methanoculleus)，甲烷鬃菌属(methanosaeta)，甲烷螺菌属(methanospirillum)和马氏甲烷八叠球菌(methanosarcinamazei)等类群。经PCR—DGGE分析，沼气池中细菌因运行阶段和运行状况的不同而有所不同，启动期主要是Y．变形菌纲(gammaproteobacterium)和杆菌(bacillus)，正常产气阶段和运行末期主要是真杆菌属(eubacterium)细菌，另一采样点沼气池中拟杆菌纲(bacteroidetes)细菌为另～优势微生物群；沼气池运行的不同阶段，古菌均以氢营养型的甲烷粒菌属(methanocorpusculum)为主，另一采样点正常池中以甲烷袋状菌属(methanoculleus)和甲烷鬃菌属(methanosaeta)为主。较之产甲烷古菌，细菌多样性丰富得多。关键词：沼气池，微生物群落，MPN，T-A克隆，DGGEAbstractToknowmoredetailsaboutmicrobialcommunityinbiogasdigesters，especiallythestructureandvarietyofmethanoarchaeacommunity,couldprovidemicrobialparametersforbetterdesigningoftheprocessofbiogasfermentation．MPN(mostprobablenumber)technique，●AcloningandDGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis)methodswereappliedtOstudythevarietyofmicrobialcommunityandmethanoarchaeacommunitystructureinbiogasdigestersinthisarticle．Therearg9．5x107cells／mland2．5xlocells／rnlfermentativebacteriaineachnormaldigesters．Cellulyticanaerobicbacteriaare9．5x10cells／ml，mehanoarchaeaare4．5x100cells／mland2．5x10’cells／nil．Sulfatereducingbacteriaare4．5x10cells／mland1．5xloceIls／m1．Thebacteriaandmethanoarchaealibrarieswereconstructedseparately．Throughthepublicdatabases(GenBank)blasted．Tobacteria，thedominantclusterisunculturedbacteria，othersareclostridiales，syntrophusandgammaproteobacterium．Someof16SrDNAsequencessimilaritiesarelow(<95％)．Tomethanoarchaea,methan