脱氢酶活性检测水质毒性方法改进-陈莉

中国环境科学学会学术年会论文集(2(X刃)脱氢酶活性检测水质毒性方法改进陈莉梁文艳李炯郭思远杨硕黎亮北京林业大学环境科学与工程学院北京1《XK)83摘要本文从培养基配方、菌种来源、激活时间、菌液用量以及检测方式这几个方面对脱氢酶快速毒性检测法进行了改进,确定了整个体系的操作方法。并用H邪l:和NaN3验证了改进后方法的可行性。结果表明,以天然地表水作为菌种来源,转接培养l次后,混合细菌的脱氢醉活性基稳定性便可达到实验要求。样品液与菌液按照6:1的比例混合效果较好。混合体系在37℃恒温培养箱中激活50min以上细菌可完全活化,最终检测可用普通分光光度计进行。关扭词脱氢酶混合细菌毒性检测一、引言脱氢酶是一类蛋白质,能够激活某些特殊的氢原子,使这些氢原子被适当的受氢体转移而将原来的物质氧化。生物体的脱氢酶活性(DHA)在很大程度上反映了生物体的活性状态,能直接表示生物细胞对其基质降解能力的强弱川。因此,脱氢酶活性检测被广泛应用于污水生化处理、细菌菌落总数检验、水质毒性检验、土壤污染评价等研究与应用领域〔幻。D.Uu曾描述一种微生物脱氢酶活性法,可以用于测定环境水样的毒性,他采用刃天青作为氧化还原染料,指示脱氢酶的活性【’]。1997年,军事医学科学院卫生学环境医学研究所与南开大学环科系对D.Uu等人的方法做了改进,采用亚甲基蓝做供氢体,使用经改制的分光光度计(分光光度计检测池中设置恒温控制),测定了水中多种重金属的毒性。并将它与传统的生物毒性试验比较显示出较好的相关性【‘]。随后他们进一步验证了所用计算Ec,经验公式的可靠性[,]。后者的方法更加经济、快速而且操作简便。本实验先对军事医学科学院环境医学研究所与南开大学环科系的方法进行了重复,实验中发现他们的方法在操作上存在一些不足。首先,使用他们提供的方式培养出的混合细菌无法长时间维持混合细菌的脱氢酶活性;第二,该方法中描述的激活20min只适用于当天培养的新鲜细菌,而无法使经4℃冰箱中保存后的菌液完全活化;第三,该方法对样品液和菌液的混合配比没有严格的规定;第四,他们的方法中需要用到一种水质毒性快速测定仪,该仪器市场占有量不大,很难购买。针对这几点不足,本实验对该方法的操作方式及数据处理方法进行了改进,不仅使该方法更加系统化,规范化,而且使检测可以在普通分光光度计上进行。二、材料与方法(一)脱氮酶活性浏定方法取10而比色皿,加人一定量的待测样品和菌液,轻轻滴加液体石蜡作为液封,于37℃恒温培养箱(250B型生化培养箱,江苏金坛汉康)中放置一段时间,使细菌活化并除氧。将比色皿放人分光光度计(UV一7504紫外可见分光光度计,上海欣茂)中,加人0.01%的亚甲基兰溶液0.1耐,于620nm波长下进行检测。每隔5s记录一次吸光度值,直至其下降到初始吸光度值的80%以下。以去离子水做空白实验。(二)亚甲基兰褪色率计算方法某段时间内亚甲基兰的褪色率用公式(l)进行计算。巡云理、lo%I性(l)第二章环境污染防治技术研究与开发式中:Q—某段时间内亚甲基兰的褪色率;-材—计时开始时体系的吸光度值;刃—计时结束时体系的吸光度值。(三)毒物EC,计算方法阎根据记录画出每次实验的吸光度一时间变化曲线,利用内插法找到混合物吸光度值下降到其初始吸光度的so%时对应的时间。然后采用公式(2)计算相对毒性A(%)的行(进IT-、.。。A二!--生一llXI几幻、几一I式中:声—样品溶液响应值即加人样品的亚甲基兰溶液褪色时间;兀—空白溶液响应值即加人去离子水的亚甲基兰溶液褪色时间。根据毒性物质在不同浓度下的A值,用下面的经验公式将剂量响应曲线转化成直线,线性回归。上_CO.11A一了入万一了(3)式中:C—待测毒物浓度;c0、B—线性回归系数。定义T,二2几,即A二10时毒性物质的浓度为毒物的半数响应浓度EC5o的值。(四)实验操作1.液体培养基确定查阅众多资料后发现,目前脱氢酶活性实验中用于培养混合细菌的液体培养基主要有两种配方。本实验分别用这两种培养基培养混合细菌,并测定菌液的稳定性及脱氢酶活性。从而确定最佳配方。吸取4耐天然地表水于装有20耐液体培养基的50耐三角瓶中,37℃恒温培养12h。培养期间从第7小时开始每小时取一部分菌液出来测定其脱氢酶活性。培养结束后将菌液放人4℃冰箱冷藏,每6h取一部分菌液出来测定其脱氢酶活性。配方一图:液体培养基:称取磷酸二氢钠2.649、磷酸氢二钾1.649、葡萄糖2.吨、氯化钠59、牛肉膏1.09、蛋白陈59,加人去离子水,定容至l《xx〕ml,于121℃高压消毒15min后4℃冷藏备用。配方二[’]:液体培养基:称取磷酸二氢钾1.649、磷酸氢二钾2.649、葡萄糖0.209、醋酸钠0.209、牛肉膏39、蛋白脉109、抓化钠59,加人去离子水,定容至l《xx〕nil