牛粪沼气发酵过程中物质转化-微生物生理群变化及产甲烷菌多样性研究

中国沼气ChinaB衣啥区,2印5,23(增刊)181牛粪沼气发酵过程中物质转化、微生物生理群变化及产甲烷菌多样性研究汪婷,何健,赵子如,李顺鹏‘(南京农业大学生命科学学院微生物学系农业部农业环境微生物工程重点开放实验室,南京21“刃5)中图分类号:5216.4文献标识码:A文章编号:lXX)一1肠(2(X)5)印一0181一06我国奶牛养殖近年来得到了极大的发展,但与之俱来的是产生了大量的奶牛粪便,据统计每头奶牛日产鲜牛粪约30公斤,牛尿和冲洗废水150公斤,奶牛粪便已成为我国农村环境主要污染源之一。沼气发酵是奶牛粪便最有应用前景的处理工艺之一,在使奶牛粪便无害化的同时,产生的沼液沼渣可作为有机肥料,沼气可作为能源。但是由于奶牛粪便有机质浓度和难降解的纤维素含量高,作为原料进行沼气发酵时,普遍存在调试启动慢,运行过程不稳定,易出现酸化和不产气或产气率低等问题,这已经在很大程度上制约了沼气发酵在奶牛粪便处理中的应用。对奶牛粪便沼气发酵物质转化及其微生物种群变化过程进行研究,对奶牛粪便沼气发酵的快速启动、产气率提高和稳定运行具有非常重要的意义。1材料与方法:1.1材料本试验中用来沼气发酵的发酵基质采自南京市江宁区锁石村牛奶场的新鲜奶牛牛粪,总固体含量24.6%,挥发性固体含量16.9%,凯氏氮含量5125mg’L一‘。1.2奶牛粪便和沼气发酵液的理化性质和沼气发酵模拟过程发酵模拟装置和模拟过程:模拟发酵器为5以刃时小口棕色试剂瓶,密封,外接0.5升湿式气体流量计收集气体。物料稀释4倍,一次性加人,添加适量的N氏Cl调节碳氮比为25一30:1。模拟发酵过程中控制温度在30℃左右进行。1.3样品理化指标分析方法:固形物含量:烘干法(105℃烘干至恒重);挥发性固形物含量:减重法(50一以刀℃灼烧三小时);pH值:P比J一4A型pH计;挥发性有机酸含量:比色法,参照文献〔’〕;凯氏氮含量:凯氏定氮法,参照文献〔‘];甲烷含量:岛津GC一14B气相色谱仪,采用灯/尼2几/S毛细管色谱柱,FID检测器,检测器温度:120℃,进样口温度:10℃,柱温:80℃。姚:燃烧气,50kPa,空气:助燃气,50kPa,姚:载气,40kPa。1.4生理群计数沼气发酵过程中的好气氨化菌、厌氧氨化菌、好氧产酸菌、厌氧产酸菌、厌氧纤维素降解菌和产甲烷菌采用MPN法计数,培养基配制和操作参照文献[2,3〕进行。1.5产甲烷菌的富集培养和分离采用hungate滚管技术分离产甲烷菌,参照文献叫进行。1.6发酵基质及沼液中的总DNA的提取:由于直接法囚提取的总DNA中腐殖质含量较高,干扰下一步PcR扩增的肠q酶的活性,无法有效地扩增出所需的165片断,因此采用改进后的间接法[0]提取总DNA。详细步骤参考文献川的方法。1.7克隆文库的构建及产甲烷菌165rDNA的RFLI》分析以产甲烷菌165刃NA特异性引物[81Met83F(sv一AcKcm℃AGI决AeAc一3v),Met134on(SV一CG〔;TCT-CTGCAA以;AG一3v),扩增出产甲烷菌165rDNA片段,PCR扩增体系为25沁,其中roxPCR扩增缓冲液2.5拜l,由汀I)52.5拜l(2,5mol·L一‘),一对引物各0.5:,l(25卿l·L一‘),Taq酶ZU以及适量模板,pCR扩增条件为:94℃预变性3而n,94℃变性305,58℃复性305,72℃延伸905,共30个循环,最后在72℃再延182汪婷,等:牛粪沼气发酵过程中物质转化、微生物生理群变化及产甲烷菌多样性研究伸10而n。PCR产物纯化后,与pMD18一T载体连接,转化E.coliD扔。感受态细胞,挑取阳性克隆,提取质粒验证。选用限制性内切酶为乞召1和你。n分别对所扩增的阳性克隆子的165rDNA进行酶切分析,在2%琼脂糖凝胶上进行电泳并分析比较酶切类型种类和分布情况。1.8序列分析产甲烷菌16SrDNA由上海联合基因生物技术公司进行测序,所得的序列在RDP中先利用C甩CK-cHIMER进行序列有效性验证后进行SEQUENCE一琳TCH,找出RDP(Ri加somalDatabase倒ect:htP:刀记p.Cme.msu.edu)库中相关序列,同时在NCBI上利用Blast搜索诀nBank上所有序列,找出相关序列,确定样品中所含的产甲烷菌所属的类群。2结果与分析2.1厌氧反应器中微生物生理群数量变化以5升的厌氧反应器作为一次投料沼气池,在实验室模拟了奶牛粪便沼气发酵过程。在为期56天的一次投料的恒温(30℃)沼气发酵过程中,大体可以分为发酵启动期、盛产期和末期三个阶段。反应器中微生物生理群数量变化关系见图1。在发酵初期,好氧性细菌增殖迅速,好氧产酸细菌和好氧氨化细菌数量均上升了近2个数量级,到达了发酵全过程的最高菌数,此后数量快速