PCR技术在水体微生物检测中的应用

PCR技术在水体微生物检测中的应用戴睿夏四清!同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室上海200092摘要聚合酶链式反应(PCR)技术因其特异性强灵敏度高以及快速简便等优点广泛应用于水体微生物的检测综述了PCR技术的原理方法及其在水体微生物检测中的研究进展主要介绍了该技术应用于水环境中微生物病原体的检测污水生物处理过程的监测与评价中的重要意义以及本实验室在该领域的研究进展PCR技术为在分子水平上进行环境微生物的结构多样性分析提供了有力的实验手段有着广泛的应用前景关键词聚合酶链式反应DNA水体微生物中图分类号X830.2文献标识码A文章编号1003-6504(2006)09-0103-03聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction简称PCR)技术最早是1985年由美国人类基因学会(ASHG)年会在DNA片段扩增工作研究中得以描述近年来随着PCR技术的不断发展与完善它在环境微生物学中得到了广泛的应用该技术通过选择某一微生物物种的一段特异性基因区域即所谓目标序列进行体外扩增然后结合凝胶电泳等技术对扩增产物进行分析从而确定环境样品中微生物的种类与含量该法不仅具有特异性好灵敏度高快速简便和可重复性等优点而且克服了传统微生物技术中丢失微生物多样性不能正确反映微生态等缺点与此同时现有许多分子生物学技术都是在PCR扩增的基础上来鉴定微生物群落中原本含量很低的DNA序列从而可以对环境微生物的群落结构进行全面分析因此该技术越来越受到环境工作者的青睐1PCR技术的基本原理与方法PCR技术是一种利用DNA变性与复性原理在体外进行特定序列DNA片段快速扩增的有效方法该技术利用两段寡核苷酸作为反应的引物以及四种脱氧核苷三磷酸dNTPDNA聚合酶作为反应物将提取到的DNA称为模板DNA片段精确扩增[1]PCR反应包括双链DNA模板DNA加热变性为单链引物与模板DNA单链结合以及在DNA聚合酶作用下的引物延伸三个阶段反应时在PCR反应缓冲液中分别加入一定量的DNA聚合酶待扩增DNA样品一对引物及4种脱氧核苷酸dNTP首先加热94!使模板DNA变性解链为单链DNA随即一对引物分别与模板DNA的两条单链的两端互补杂交此时引物的3端相对5端相背而后在适宜温度pH值及离子强度下由TagDNA聚合酶催化引物引导DNA链由5向3延伸从而完成一个变性复性延伸的PCR循环至此完成了PCR的第一轮反应而后反复进行变性复性和延伸的循环从而使扩增DNA产量呈指数上升2PCR技术在水环境微生物病原体检测中的应用水中的微生物病原体可划分为四类病毒细菌病原原生动物病原蠕虫其中大部分为肠源性即由粪便污染环境再通过消化道侵入新的宿主由于水源最容易受到人类及动物粪便的污染同时还有一些非肠源性的病原体如军团杆菌分歧杆菌等也可能进入水体造成污染因此污水和原水中存在的微生物病原体是世界范围内威胁公众健康的主要问题对该类病原体进行检测对于监测水质或是评价污水处理效果有重要意义传统检测方法是对病原体进行人工培养或细胞培养或是对无法培养的病原体进行显微镜检测这些方法不仅耗费大量的人力物力和财力而且准确度差采用PCR技术检测水环境中的微生物病原体无需培养而是直接取样进行分析特异性强灵敏度高迅速简便且具有较高的精确度病毒是水中最危险的病原体感染性高致病剂量低且难于检测常规检测技术通常是首先富集培养而后采用电镜观察等方法耗费大量人力财力且精确度差而采用PCR技术可以克服常规方法的局限性同时可以大大增加病毒的检测范围及数量Atmar[2]等利用PCR技术在水中检测到诺沃克病毒和甲肝病毒Chung[3]等通过对细胞培养物进行PCR扩增在水样中检测到甲肝病毒和肠道病毒研究结果表明检测效率比单纯细胞培养提高了50!Brooks[4]等对雨季时海水中的甲肝病毒采用RT-PCRreal-timePCR实时PCR进行了检测及定量分析研究证明该技术对甲肝病毒的定性及定量测定均有很高的精确度同时指出了PCR技术对于环境微生物定量测定的发展前景对于水中的大部分细菌通常采用分离培养来鉴基金项目上海市曙光计划资助项目03SG20作者简介戴睿1982-女在读硕士主要从事环境工程微生物方面的研究工作手机13795486526电子信箱diary_8219@163.comPCR技术在水体微生物检测中的应用戴睿等103第29卷第9期2006年9月定它们的种类和数量9但是分离方法和培养基的选择是限制检测效率的问题所在;同时9还有一部分细菌由于不能在人工培养基上生长9使得鉴定的细菌种类和数量低于环境中的实际值0采用PCR技术可以对水中的细菌进行直接检测9从而可以缩短检测时间扩大检测范围0Tsen[5]等通过选择大肠杆菌的16srRNA片段进行PCR扩增来检测水中的大肠杆菌细胞0通过富集9可以达到1E..colicell/1O