SHARON生物膜中微生物多样性的研究

湖南大学硕士学位论文SHARON生物膜中微生物多样性的研究姓名：董远湘申请学位级别：硕士专业：环境科学指导教师：李小明20060425硕士学位论文摘要随着环境科学的发展，对环境微生物群落的分析也越来越重要。近年来发展起来的分子生态学技术可以较好的解决传统方法的缺陷。本研究利用分子生态学技术分析了SHARON生物膜中的微生物群落的多样性随时间、溶解氧和水力停留时间的不同而有所变化以及部分微生物的系统进化关系。通过实验得到的主要研究结论如下：通过三种总DNA提取方法的对比，得出一种操作比较简单、且无需购买其它专用仪器设备的化学方法；并用此方法提取了SHARON生物膜各阶段的样品的总DNA，所得总DNA能够满足环境微生物群落分析的要求。根据PCR的原理和特点，探讨得出了适合本实验样品的PCR反应体系和反应程序；运用此条件对SHARON生物膜个阶段样品进行了PCR扩增，所有样品90％以上都得到了220bp左右的特定DNA片段，此结构能够满足DGGE分离的条件；同时实验中必须要注意PCR扩增的污染问题，因为此问题将影响PCR扩增的结果。利用DGGE分离技术，对PCR扩增得到的各样品的特定DNA片段进行了分离，对PCR扩增得到的各样品的特定DNA片段进行了分离，在生物膜启动期时的样品中可以分离出二十条以上的单一条带：在生物膜稳定初期时的样品由于溶解氧和水力停留时间分别控制在O．5mg／1和1．2h以下，所以每个样品分离出十条以下的单一条带：在生物膜稳定期，发现每个样品分离出了三十条左右的单一条带：初步得出了生物膜中微生物群落的生物多样性和微生物的大致数量比例关系；通过对生物膜不同时间的微生物群落的变化情况仞步分析了外界条件对微生物群落结构的影响。对DGGE分离的部分单一DNA条带进行了测序，利用Blast软件对测序结果在GenBank数据库中进行了同源性对比，所得结果表明生物膜在启动时期主导菌为硝化菌(Nitrospira)、亚硝化菌(Nitrosospira和Nilrosomonas)以及少量的异氧菌等；在生物膜稳定初期由于生物膜处于低溶解氧阶段，其测序的结果表明此阶段主要是厌氧氨氧化菌(例如：Kueneniastuttgartiensis)和少量亚硝化菌(Nitrosospira)等；稳定期阶段80％-90％的硝化菌被洗掉，其大部分为亚硝化菌(Nitrosospira和Nitrosomonas)还有少量的异氧菌和厌氧氨氧化菌：本研究还利用BioEdit软件对生物膜个阶段测序条带进行了进化系统分析，画出了系统发育树，得到了他们之间的进化关系。通过本实验对生物膜种群的分析得出，溶解氧和水力停留时问是控制SHARON反应器的关键因素，其最佳控制条件为溶解氧控制在0．5～1，0mg／l，水力停留时间为1．Oh，能够实现匹配的厌氧氨氧化的SHARON工艺，其它的条件温SHARON生物膜中微生物多样性的研究度对反应器影响不大。关键词：分子生态学聚合酶链式反应SHARON变性凝胶梯度电泳lI硕十学位论文ABSTRACTWiththedevelopmentofenvironmentalscience，analysisoncommunityofenvironmentalmicroorganismshasbecomemoreandmoreimportant．Becausethetraditionalanalyticalmethodhasdefects，itcan’tmeettherequestforenvironmentalanalysis．Defectoftraditionmethodcanbesettledbyecologicaltechnologyofmoleculedevelopedinrecentyears．Thediversitychangesofcommunityofenvironmentalmicroorganismwithdifferencethetime，thedissolvedoxygenandthehydraulicretentiontimeandtheevolutionofsomemicroorganisminSHARONbiofilmshavebeenanalyzedbymolecularecologicalmethod．Themainresearchconclusionreceivedthroughtheexperimentisasfollows：UnderthecontrastofthreetotalDNAextractingmethods，oneeasy，simpleandnon—specialdevicechemicalmethodofcrudeDNAextractionwasfound．ThecrudeDNAofth