正交法研究光合细菌的混合培养

微生态制剂培养技术—正交法研究光合细菌的混合培养摘要利用光合细菌和蜡样芽孢杆菌协同生长的特点进行混菌培养试验。蜡样芽孢杆菌好氧，光合细菌兼性厌氧，通过两种细菌的不同添加比例，寻找一种最好的添加比例，使光合细菌活菌数在最短的时间内达到最大值。试验过程中，采用正交试验对两种菌的比例进行了科学的组合，从而找到两种菌的最佳配比：在光合细菌1%或5%、芽孢杆菌1%的添加量的情况下，可以在最短的时间内使光合细菌菌数达到理想值。关键词光合细菌；混菌培养；正交法近年来,随着生活水平的提高,人们对畜禽产品质量的要求越来越高,绿色食品越来越受到消费者的青睐。因光合细菌营养丰富,提高畜禽免疫力方面效果显著,而且在水产养殖方面,能净化水质,提供一部分活性氧,所以很多研究者对其尤为重视[1-3]。但因为光合细菌培养周期长,菌数很难达到人们要求,所以,研究者采用各种方法进行了光合细菌混菌培养试验的研究。GiraudEZ和FleischmanD(2004)研究发现,当光合细菌与根瘤菌共同培养时,可增强根瘤菌抗干扰能力,储藏的时间更长,在豆科植物上能形成更有效的根瘤,从而增加植物的产量[4]。李勤生等(1998)采用光合细菌不同菌株、光合细菌菌株与异养菌株混合培养,试验结果发现,不同组合的混合培养物其生长量均不同程度的高于单株培养物,最高增长量高达17.4%,最低也高于对照组[5]。本试验是在光合细菌单菌培养的基础上,进行了光合细菌和芽孢杆菌的混菌培养,目的就是提高光合细菌的生长速度,缩短培养周期,增加光合细菌的活菌数。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种光合细菌(9.0×108CFU/ml)和蜡样芽孢杆菌(1.0×109CFU/ml)均由本实验室分离、筛选、鉴定、保存。1.1.2培养基1.1.2.1光合细菌富集培养基乙酸钠3.0g、丙酸钠0.3g、NaCl1.0g、(NH4)2SO40.3g、MgSO40.2g、KH2PO40.5g、K2HSO40.3g、CaCl250mg、MnSO42.5mg、FeSO45mg、酵母膏0.lg、蛋白胨10mg、谷氨酸0.2mg、H2O1000ml,将以上组分溶于水后调pH值为7.4,然后在121.0℃蒸汽灭菌30min。1.1.2.2芽孢杆菌肉汤培养牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、H2O1000ml,pH值7.4～7.6,121.0℃下蒸汽灭菌30min。1.1.2.3芽孢杆菌平板普通培养基在肉汤培养基的基础之上,加入琼脂1.0%,121.0℃下蒸汽灭菌30min。1.1.2.4光合细菌计数培养基NaHCO31.0g、CH3COONa3.0g、酵母膏2.0g、K2HPO40.5g、Fe-EDTA0.005g、NH4Cl1.0g、MgCl2·6H2O0.2g、NaCl5.0g、H2O1000ml,pH值7.4～7.6、121.0℃下蒸汽灭菌30min。1.1.3仪器微量加样器、平板、1ml移液管、漩涡振荡器、试管等。1.2培养方式和条件1.2.1蜡样芽孢杆菌摇床培养用接种环刮取斜面保存的蜡样芽孢杆菌,平板划线,进行活化,37℃培养24h。使用灭菌的250ml三角瓶装芽孢杆菌肉汤培养基30～40ml,从平板上刮取菌落,接种到肉汤培养基上,37℃、130r/min摇床培养24h。1.2.2光合细菌富集培养[6]使用光合细菌富集培养基,在温度28℃,光照60W,光源距离培养物10～20cm,光照强度大约在600～1900LX之间。选择1000ml的三角瓶,装入1000ml光合细菌富集培养基,按不同比例接菌,使用封口膜封口,然后光照培养6～8d,观察颜色变化。颜色黑红色时保存,供混菌培养使用。试验研究《饲料工业》·2007年第28卷第4期311.2.3光合细菌和蜡样芽孢杆菌混合培养光合细菌富集培养基分装于消毒后的200ml三角瓶中,接种时采用光合细菌与蜡样芽孢杆菌同时接种,其中光合细菌1%、5%、10%、20%4个水平,而蜡样芽孢杆菌采用0.1%、0.5%、1%、2%4个水平,用正交组合法接种,然后按光合细菌富集培养条件进行光照培养。每隔24h采样一次,进行光合细菌计数培养,连续采样8d,每天计数培养一次。1.2.4细菌计数培养1.2.4.1菌液稀释采用常规方法对菌液稀释,即用移液管0.5ml菌液移于盛有4.5ml无菌水的试管中,漩涡振荡5次,每次10s,以此类推,将菌液稀释至10-6、10-7、10-8。1.2.4.2光合细菌计数培养用1ml移液管取不同稀释度(一般为10-6、10-7、10-8)和不同接种比例的混合培养后的菌液1ml,加到灭菌的平板上,然后加20ml灭菌的(45±1)℃光合细菌计数培养基,琼脂含量0.8%,摇匀;培养基冷凝后上层加5ml灭菌的(45±1)℃1.0%的琼脂,冷却后置25～30℃