正交法研究光合细菌计数培养基

正交法研究光合细菌计数培养基摘要:利用正交设计试验法研究了碳源、酵母膏、微量元素、磷酸盐、铁盐、琼脂等6个因子对光合细菌培养计数的影响,确定了各因素的最佳配比,其结果是:NaHCO31.0g,CH3COONa3.0g,酵母膏2.0g,微量元素0ml/L,K2HPO40.5g,Fe-EDTA0.005g,琼脂8g。该组合加上NH4Cl1.0g,MgCl2.6H2O0.2g,NaCl5.0g,dH2O1000mL,即得出光合细菌计数培养基,称之为R培养基。该培养基对光合细菌的检测具有准确、快速、简便等优点。关键词:光合细菌;培养基;正交法1前言光合细菌(PhotosyntheticBacteria,简称PSB)是一大类能进行不产氧光合作用的细菌,由于它具有能利用有机小分子作为碳源的生理特性,且菌体本身又无毒无害、营养丰富的特点,因而在水产养殖、废水处理等行业中得到了广泛应用,并在新能源开发、种植业、食品、化妆品、医药保健等行业显示出广阔的应用前景[1,2],特别是在水产养殖方面,随着可持续发展理念的兴起,光合细菌在水产健康养殖中扮演着越来越重要的角色,并正进入了一个快速发展阶段。但是由于缺乏统一的检测方法,光合细菌的主要指标,即活菌密度一直无从准确测定,致使光合细菌制剂至今还没有国家标准,由此造成光合细菌市场鱼龙混杂,反而成为水产养殖及环境生态的一大隐患。目前,有关光合细菌的重点仍在菌种的分离、培养及其应用技术的研究,研究中对光合细菌培养量的评估,基本上是采用光电比色法或显微直接计数法。由于市售光合细菌制剂存在菌种复合、杂菌污染、培养基质干扰以及色素掺假等问题,上述两种方法显然不够准确,光合细菌的准确计数必须通过菌落计数来确定。然而目前这方面的报道还很少,仅见孙军德等人[3]作了光合细菌双层平板计数法的研究,而该报道只是针对实验室某一纯培养物的研究结果,还难以推广应用。本文采用正交法研究出光合细菌的计数培养基,即R培养基,经验证,该培养基对光合细菌的检测具有专一性和特异性,而且快速简便,在实际应用中效果良好。2材料与方法2.1试验材料光合细菌菌种:沼泽红假单胞菌(Rhodopseu-domonaspalustris)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonassphaeroids)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonascapsu-late)混合培养物,由华东师范大学环境科学研究所提供,浑球红假单胞菌RS601(Rhodopseudomonasspheroids)由中科院上海植物生理研究所提供,红球菌AB96026(Rhodococcussp.)由中国典型培养物保藏中心提供。其他菌种:桔橙色动球菌AA98005(Kineococcusaurantiacus)、桔橙小单胞菌AA95041(Micromonosporaaurantiaca)、深红酵母AY91005(Rhodotorularubra)、红酵母AY93148(Rhodotorulasp.)、金黄色葡萄球菌AB91053(Staphylococcusaureus)、大肠埃希氏杆菌AB90054(Escherichiacoli)、鼠伤寒沙门氏菌AB94007(Salmonellatyphimurium)、痢疾志贺氏菌AB200058(Shigelladysenteriae)由中国典型培养物保藏中心提供。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)由本实验室从海水中分离并经VITEK-AMS鉴定至种。所用试剂均为分析纯。2.2方法2.2.1光合细菌培养条件的确定参照文献[3~7],选择光合细菌的培养条件为:温度28e~30e,光照强度3000Lx,培养72h,如果菌落#45#2004年检验检疫科学第14卷第1期*作者简介:刘军义(1966-),男,中科院武汉病毒研究所毕业,理学硕士,已发表论文15篇。表1试验因子水平因子水平因子种类及其代号A碳源(g)B酵母膏(g)C微量元素贮液(mL)D磷酸盐(g)E铁盐(g)F琼脂(g)一水平NaHCO32.01.03KH2PO40.50.28二水平NaHCO34.01.55K2HPO40.50.120三水平NaHCO31.0CH3COONa3.02.00.5KH2PO40.250.0255四水平NaHCO32.0丁二酸钠1.0CH3COONa2.00.10K2HPO40.3KH2PO40.50.00515五水平NaHCO32.5CH3COONa2.50.51KH2PO40.050.0510不明显,则继续培养48h。2.2.2光合细菌的菌落计数方法选用合适的连续3个菌液稀释度,接种于25mL的具塞比色管内,每个稀释度用两只试管,迅速倾注20mL已融化放冷至45