青霉菌发酵和超滤耦合制备壳低聚糖

食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES10�2007Vol�33No�7(Total235)青霉菌发酵和超滤耦合制备壳低聚糖*张�匡,郑连英(浙江大学生物工程研究所,浙江杭州,310027)摘�要�在5L发酵罐中,采用高产壳聚糖酶菌株Penicilliumsp.ZD�Z1,经半连续发酵和超滤耦合制备不同分子质量壳低聚糖。考察了稀释率、壳聚糖浓度、发酵时间对菌体生长和产量的影响。理想条件为:当稀释率为0�15h-1,流加壳聚糖浓度为3%的培养基,发酵96h后,壳低聚糖产量提高了5倍。采用不同截留分子质量(MWCO)超滤膜分离不同分子质量的壳低聚糖。通过喷雾干燥获得高纯度壳低聚糖样品。关键词�壳聚糖,发酵,超滤,耦合,壳低聚糖第一作者:硕士研究生(郑连英教授为通讯作者)。�*国家自然科学基金重点项目(50233020)和浙江省重点科技项目(2005C22001)资助收稿日期:2007-02-02��壳聚糖在医药、食品、化妆品、农业、环保等领域已得到广泛的应用,它的相对分子质量起着至关重要的作用[1~3]。由壳聚糖酶降解壳聚糖得到的小分子质量壳低聚糖,易溶于水,易被人体吸收。相对于5000~10000u大分子质量的壳低聚糖显示出更强的抑菌性能和生物活性。在治疗糖尿病时,20ku壳低聚糖比140ku壳聚糖对于脂多糖有更强的亲和力。而且小分子质量壳低聚糖在抗肿瘤和DNA表达系统中也有着巨大的潜力[4~6]。笔者在前期研究中采用Penicilliumsp�ZD�Z1菌株深层间歇发酵产酶降解壳聚糖,易出现产物被大量消耗,对产品质量的稳定性及产量影响较大。而采用半连续发酵和超滤耦合制备壳低聚糖时,不断移出产物能够缓解酶解反应的产物抑制作用并且能够延长发酵时间,极大提高了酶的利用率。目前发酵和超滤的耦合主要应用在蛋白质和多糖的酶解过程[7,8],应用于发酵法连续生产壳低聚糖尚未见报道。1�材料和方法1�1�主要材料和设备菌株:高产壳聚糖酶菌株Penicilliumsp�ZD-Z1,由浙江大学生物工程研究所实验室从土壤中筛选得到。发明专利号为ZL02159880�0。壳聚糖:玉环澳兴甲壳素有限公司生产,脱乙酰度90%,分子质量290ku。5L发酵罐:GYB型,上海联环生物工程设备有限公司;超滤装置:赛普(无锡)膜科技发展有限公司;凝胶色谱仪:150-GPC型,美国Waters公司;喷雾干燥仪:B-290型,瑞士Buchi公司。1�2�培养基斜面培养基(g/L):壳聚糖8,尿素1,K2HPO40�6,(NH4)2SO41,MgSO40�12,琼脂15,pH5�0。发酵培养基(g/L):壳聚糖30,尿素1,K2HPO40�6,(NH4)2SO41,MgSO40�12,pH5�0。1�3�发酵和超滤的耦合过程在5L发酵罐中,发酵条件为:转速180r/min,温度30�,装液量3�5L,pH4�6~5�0,发酵36h后开始耦合操作,每2h从发酵罐中取出发酵液进行抽滤,同时流加等量发酵培养基,使罐内发酵液体积保持稳定。然后依次用截留分子质量为20ku、5ku和2ku的超滤膜进行超滤。将截留的大分子壳聚糖和酶返回到发酵罐中。实验流程图如图1所示。发酵过程中每隔4h测1次还原糖浓度和菌体浓度,用来监测发酵过程。实验中研究了超滤特性、稀释率对发酵过程的影响,并且考察了不同壳聚糖浓度的发酵液发酵时的降解效果。图1�发酵和超滤耦合制备壳低聚糖的流程图1�4�壳低聚糖的分离和产品制备发酵液经抽滤除去菌体后,依次采用截留分子质量为20ku、5ku和2ku超滤膜的顺序进行超滤,得到壳低聚糖分子质量范围为5~20ku、2~5ku和2ku以下的溶液,再进行真空蒸馏浓缩,得到浓度较高的壳低聚糖溶液,最后进行喷雾干燥,得到不同分子研究报告2007年第33卷第7期(总第235期)11�质量的壳低聚糖样品。1�5�分析方法1�5�1�菌体浓度测定定时、定量取出的发酵液,经抽滤后,将菌体滤饼在80�下干燥48h后称重。1�5�2�还原糖浓度测定壳聚糖的酶解程度由发酵液中还原糖浓度表示,并且采用DNS法测定发酵液中的还原糖浓度。1�5�3�壳低聚糖测定采用凝胶渗透色谱(GPC)分析。分离柱由Wa�tersUltrahydrogel(1000,250,120)串联。测试温度30�,流动相:0�2mol/LHAc+0�1mol/LNaAc,流动相流速0�8mL/min。标准品采用葡聚糖。2�结果和讨论2�1�稀释率的影响在壳聚糖浓度为2%的发酵液中,稀释率分别为0�20h-1、0�15h-1和0�10h-1时,考察发酵液中的菌体浓度,半连续操作始于第36h。图2�稀释率对发酵过程中细胞浓度的影响��如图2所示,当稀释率为0�20h-1时,发酵液中菌体的生长量