葡聚糖-卵粘蛋白亲和超滤载体的制备及应用

华南理工大学学报(自然科学版)第39卷第5期JournalofSouthChinaUniversityofTechnologyVol．39No．52011年5月(NaturalScienceEdition)May2011文章编号:1000-565X(2011)05-0160-05收稿日期:2011-01-29*基金项目:国家自然科学基金资助项目(30871751);暨南大学博士科研启动基金资助项目(51205012)作者简介:李存芝(1969-)，女，博士，讲师，主要从事食品化学、食品加工研究．E-mail:tlicz@jnu．edu．cn通讯作者:李琳(1963-)，男，博士，教授，主要从事糖类物质及其药物的制备与生物利用研究．E-mail:felinl@scut．edu．cn葡聚糖－卵粘蛋白亲和超滤载体的制备及应用*李存芝1黄雪松1唐书泽1李琳2张广文1胡长鹰1(1．暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632;2．华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)摘要:为探讨葡聚糖－卵粘蛋白亲和超滤载体的制备机理及应用效果，首先用相对分子质量为200万的葡聚糖，经环氧氯丙烷活化，以卵粘蛋白为配基合成水溶性载体，然后用该载体对胰蛋白酶进行亲和超滤纯化并进行相关的紫外、红外光谱分析．结果表明:载体的活化历程为双分子亲核取代反应(SN2);合成的载体对胰蛋白酶的吸附符合Lang-muir吸附等温线方程，纯化倍数达45，活性回收率达80%;葡聚糖－卵粘蛋白载体对胰蛋白酶具有高度的亲和特异性，在亲和超滤过程中对胰蛋白酶具有很好的纯化效果．关键词:亲和超滤;葡聚糖;卵粘蛋白;环氧氯丙烷;胰蛋白酶中图分类号:TQ028．8;Q55doi:10．3969/j．issn．1000-565X．2011．05．028亲和－膜过滤技术也称作亲和错流过滤，由Adamsi-Medda等［1］于1981年提出，它将水溶性或非水溶性高分子亲和载体与目标蛋白进行特异性可逆反应，然后用膜进行错流过滤，兼具生物亲和与膜分离的优势．目前研究非水溶性亲和载体的较多，即通过对滤膜改性，使其具有亲和吸附目标物质的特性，宜于操作［2-3］．水溶性亲和载体与目标分子在均相中吸附和洗脱，反应速度快，达到平衡时间短，与非水溶性亲和载体比较具有显著优势．目前相关的报道集中在水溶性载体的应用［4-8］，在载体的制备及机理上的较少．文献［9］中以合成的相对分子质量为10万的聚丙烯酰胺为水溶性载体分离胰蛋白酶．考虑到聚丙烯酰胺的潜在不安全性且卵粘蛋白是胰蛋白酶的抑制剂［10］，本研究采用对人体安全的相对分子质量为200万的水溶性葡聚糖，对其活化后连接卵粘蛋白为配基，制备卵粘蛋白－葡聚糖亲和载体，以卵粘蛋白作为胰蛋白酶的特异抑制剂，分析载体活化过程的相关机理，并将制备的亲和超滤载体应用于胰蛋白酶的纯化．1实验材料与方法1．1主要材料和设备葡聚糖T2000(相对分子质量为200万)．卵粘蛋白、胰凝乳蛋白酶(结晶纯)，均购自Sigma公司;胰蛋白酶(1∶250，即每克酶制剂含250个酶活力单位)，购自上海伯奥生物科技公司;其它试剂为国产分析纯．UV-2102PC型紫外－可见分光光度计，由上海UNICO公司生产;傅里叶变换红外光谱仪Vector33，由德国Bruker公司生产;WZZ-1SS数字式自动糖度旋光仪，由上海物理光学仪器厂生产;搅拌式超滤杯(450mL)，由北京中科院膜技术开发中心生产;聚偏氟乙烯(PVDF)超滤膜，截流相对分子质量为10万、14万，由中国科学院上海原子核研究所生产;AL-PHA2-4真空冷冻干燥机，由德国Christ公司生产．1．2亲和载体的制备及定量分析在配料杯中加入葡聚糖T2000和氢氧化钠，使葡聚糖含量达到4%(质量分数)，氢氧化钠浓度达到0.4mol/L，磁力搅拌器搅拌使溶解完全，加入4%(体积分数)的环氧氯丙烷，搅拌分散均匀;将料液置于60℃恒温摇床中避光反应2h;反应液用截留相对分子质量为10万的PVDF膜超滤除去溶液中剩余的环氧氯丙烷、氢氧化钠小分子，冷冻干燥得活化葡聚糖．膜截留物先用蒸馏水洗至pH=8.0，再用pH=9.5的碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液清洗，将卵粘蛋白溶解在上述滤膜截留液中，使卵粘蛋白含量为6g/L，在40℃恒温摇床中避光反应24h;反应后的溶液用截留相对分子质量为14万的PVDF膜除去未被偶联的卵粘蛋白，真空冷冻干燥，获得葡聚糖－卵粘蛋白水溶性亲和超滤载体．胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活力的测定分别采用以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)、N-乙酰-L-酪氨酸乙酯ATEE为底物的酶活力测定法［11］．卵粘蛋白配基密度采用考马斯亮蓝G-250染色紫外吸收法在595nm处测定［11］．1．3载体的光谱分析1．3．1紫外－可见光吸收光谱