利用PCR-DGGE技术鉴定氯酚降解菌株

第19卷2期2011年4月应用基础与工程科学学报JOURNALOFBASICSCIENCEANDENGINEERINGV01．19．No．2April2011文章编号：1005-0930(2011)02-0196-008中图分类号：X52文献标识码：Adoi：10．3969／j．issn．1005-0930．2011．02．003利用PCR．DGGE技术鉴定氯酚降解菌株尹艳华，胡学敏，陈沙沙(北京理工大学化工与环境学院，生态工业研究所，北京100081)摘要：为鉴定好氧厌氧固载工艺降解2，4-DCP和2，4，6-TCP优势菌株，分析2，4．DCP和2，4，6-TCP降解机理，取连续运行60d的厌氧好氧反应器出入口微生物，利用PCR．DGGE技术，分析菌株DNA电泳结果，研究16SrDNAV3可变区的PCR产物．通过DGGE图谱聚类、测序等技术，与NCBI数据库中的基因序列相匹配。结果表明：反应器中有4种优势菌株：埃希氏菌属、梭状芽孢杆菌属、肠杆菌属和洋葱伯克霍尔德氏菌属，且均以厌氧和兼性厌氧为主．推测厌氧好氧联合固载技术降解2，4．DCP和2，4，6-TCP的方式以厌氧脱氯为主，在4种优势菌株的联合作用下，从单氧酶和氧化还原酶催化开始降解，2，4，6-TCP被单氧酶氧化成2，6．二氯对苯醌，然后化学还原成2，6一二氯一对苯二酚，最后，变成6一氯一2一羟基一对苯醌，最后继续分解为小分子、CO：和水，实现全面降解．关键词：氯酚；混合菌种；PCR．DGGE氯酚类化合物属于毒性高难降解持久性污染物，被广泛用作杀虫剂、除草剂和木材防腐剂等，在环境中大量累积，对生态环境和人类健康造成了很大危害，被美国环保局列入“优先控制污染物”黑名单⋯．到目前为止，已发现并分离出多种对氯酚类芳香化合物具有代谢能力的微生物Ⅲo，例如Burl&oMeda岫(Ps．唧袱妇)，Ps．Pickettii，Clostridiumsp．，Phanerochatechrysospo矗um，Azotobactersp．，Desulfitobacteriumdehalogenans和hesulfomoniletiedjei等，这些研究成果为今后研究降解氯酚类芳香化合物的高效菌株指引了方向．目前，随着分子生物学技术的发展，基于16SrDNA的PCR扩增多样性检测技术的应用，为鉴定多样性菌种提供了方便．利用细菌16SrDNA的通用引物，PCR产物建立16SrDNA基因克隆库，可以通过16SrDNA序列分析确定菌种身份，并与有关的16SrDNA数据库中的基因序列相匹配，建立分类学上的关系”刮．变性梯度凝胶电泳1(DenaturingGradientGelEletrophoresis，DGGE)是近年来发展起来的一种电泳检测技术，可以分辨1个碱基的差异．16SrDNA扩增产物的DGGE分析作为一种灵敏快捷的检测手段已经广泛的应用于微生物生态学及微生物多样性的研究中．目前，该技术已经应用于生物降解氯酚中的菌株鉴定，如生物方法降解五氯苯酚的微生物种群分析怫驯，Cd2+和cu2+对厌氧方法降解2．氯酚菌种的影响¨刚等，还无文献采用该方法鉴定厌氧好氧方法降解2，4·DCP和收稿日期：2010_05-Il；修订日期：2010一11-08作者简介：尹艳华(1968一)，女，高级工程师．Tel：010-68918978；E—mail：yinyh@bit．edu．cn万方数据No．2尹艳华等：利用PCR-DGGE技术鉴定氯酚降解菌株2，4，6-TCP的菌株研究．本试验提取稳定运行的厌氧好氧生物反应器中固载材料上的复合菌株，获得了一系列对2，4．DCP和2，4，6-TCP具有降解功能的菌株．采用PCR—DGGE，单菌落PCR一测序等技术，确定反应器中的优势菌种，旨在从分子生物学水平上阐明氯酚降解过程中的微生物分子生态变化特性．1材料与方法1．1实验装置及流程厌氧一好氧联合反应器装置如图1所示，由进水系统、生物处理系统、出水系统以及曝气系统组成．其中，进水系统包括进水装置A、计量泵B和进水管道；反应系统包括厌氧反应器C、好氧反应器D、载体F以及连接两个反应器的管道；出水系统包括出水管道及出水装置E；曝气系统包括曝气泵G和输气管道．u水装置景泵}，乳反应器L乳反应器水装置蚀气装置__——，／<可N]＼／|，／’k√I、图1厌氧．好氧联合反应器装置示意图rig．1Experimentalinstallationofanaerobic—aerobicreactor1．2测试的复合菌株研究的菌株为图1反应器稳定运行60d降解含氯酚污染物废水过程中，固载在大孔功能性载体reurs(北京盖雅环境科技有限公司)上的混合菌株BCP350(BIO—SYSTEMS．CO．USA)．测试样品为4个，1号和2号为厌氧反应器内