PCR-DGGE技术用于石油污染土壤中微生物群落结构多样性的初步研究

第4期PCR—DGGE技术用于石油污染土壤中微生物群落结构多样性的初步研究549由图1可见，从5个培养基样品及其土壤样品中共分离得到20个主要条带。对于A1，其培养基样品只有2个条带，而土壤样品可获得6个条带；其他几个样品也呈现出培养基样品的条带少于土壤样品所获得的条带数，表明从土壤样品中提取DNA进行土壤生境微生物群落结构和多样性的分析完全可行[9]。从5个土壤样品的条带分布可以看出，A1为6条，A2为8条，B1为10条，B2为11条，B3为9条，说明经堆肥处理后，石油污染土壤中的微生物的多样性得到了恢复；同时，经过堆肥处理的土壤中微生物的多样性在纵向上存在差异，中层土多样性最好，其次是底层土。长期被石油污染土壤的微生物多样性较刚被石油污染土壤的多样性差，这可能是由于经过长期的自然选择过程，适合重度石油污染的菌群占据了绝对的优势，导致其他类型菌群的消失；而刚被石油污染的土壤，虽然石油会对原来土壤中的微生物产生抑制作用，但由于污染时间不长，大多数菌群并没有被完全抑制。这也是造成从DGGE谱图中可以观察到更多的条带的原因，并且可以看出土壤中的一些优势菌群无法通过纯培养的方法获得，如在培养基样品的DGGE谱图中均未出现12～20条带。因此，采用单一的传统培养分离方法进行微生物群落的结构和多样性研究并不准确，有可能造成土壤生境重要功能菌群被忽视的后果。另外，从图1还可以看出，5种土样均存在相同的优势菌群(条带4、5和6)，表明这3种菌群在各种类型的石油污染土壤中均能够较好地生存繁衍。同时，从DGGE分离谱图可以看出，B1、B2和B3培养基样品获得的8、9和10条带在其土壤样品中并未出现，这是由于在从土壤样品中提取DNA的过程中，造成部分功能菌群的丢失。因此为了更加全面地对石油污染土壤生境中的微生物群落结构和多样性进行评价，采用基于培养和基于PCR—DGGE的联合方法是必要的。2．2不同土壤生境微生物群落相似性分析为了研究不同石油污染土壤之间微生物群落的相似性，依据图1(b)中土壤生境微生物种群分布数据，利用Jaccard群落相似性系数[1叩计算工具，通过SPSS10．0可以得到5个不同土壤生境之间微生物群落的相似性系数，如表1所示。相似性系数越大，表明相似性越大，差异越小。表1不同石油污染土壤生境微生物群落的Jaccard相似性系数TablelCoefficientsofJac哪dsimilarityofthemicrobialcommunityofthedifferentoilpollutedsoilhabitatCoefficientofJaccardsimilaritySampleA1A2B1B2由表l可知，不同石油污染土壤微生物群落相似性不高，这表明在石油污染类型和处理方式不同的土壤中微生物差异性较大。不同的生态条件造成微生物群落物种组成存在很大的差异，但也不排除某些土壤生境之间群落结构一定程度上的相似性，比如B2和B3以及A1和A2。土壤B2和B3分别是同一地点经堆肥处理的中层和表层土，说明同一地点在一定深度范围内土壤生境中的微生物群落组成较为均匀。但这不是绝对的，比如，同一地点的深层堆肥土壤Bl的微生物群落组成却与B2和B3有较大的差异。这是由于达到一定深度的土壤中的氧含量很低，不适合好氧功能菌群的生存，而是厌氧和兼性厌氧菌群占主导，使得深层土的微生物群落组成与中层和表层土的群落有较大的差异。A1与A2的群落相似性较高，可能是它们来自同一采油区块的土壤，虽然A2为刚被石油污染的土壤，A1为长期石油污染土壤，但通过长期的自然适应过程，该采油区块的微生物适应了污染环境，造成A1与A2当中微生物在一定程度上的相似性。同时，经人工处理的污染土壤与未经处理的污染土壤之间微生物群落组成差别非常大，表明经人工堆肥处理后的土壤微生物群落组成发生了较大的变化。3结论通过对土壤样品纯培养细菌DNA的提取和直接从土壤样品中提取基因组DNA，以及后续的PCR-D(ⅪE分析，采用基于培养和基于PCR_DGGE的联合方法测定的结果表明，污染状况不同的土壤微生物多样性存在较大的差异。(1)年代较久的石油重度污染土壤菌群数量少于轻度污染土壤，经堆肥处理的土壤生物多样性明显优于未进行人工处理的污染土壤。万方数据550石油学报(石油加工)第26卷(2)经堆肥处理的土壤，其微生物多样性在纵向上也存在差异；(3)不同污染土壤存在一定数量相同的优势菌群，但也表现了相当的差异性，经堆肥处理的污染土壤，其微生物群落组成的相似性在纵向上也存在差异。采用基于培养和基于PCR-DGGE的联合方法，能够更加全面地对石油污染土壤生境中的微生物群落结构和多样性进行评价。参考文献[11AMANNRI，LUDWIGE，SCHI。EIFERKH．Phylogeneticidentif