一种工程菌的高酶活及其固定化细胞对农药的降解

中国环境科学1999,19(5):461一465ChinaEnvironlnentalSeienee一种工程菌的高酶活及其固定化细胞对农药的降解闻艳春’,乔传令“,周晓涛3(1.山东农业大学生命科学学院,山东泰安271018:2.中国科学院动物研究所,北京10(X)80;3.北京大学生命科学院,北京10()87l)摘要:将抗性尖音库蚊五带亚种的抗有机磷农药基因一醋酶基因克隆到质粒pRL并39中.经检测,重组质粒中的醋酶基因己得到表达,获得高酶活的工程菌.将工程菌固定化后对两类难降解农药(有机氯、菊酷类)进行降解,结果表明,固定化细胞在lh内对上两类农药可降解90%以上,具有很高的降解效力.关键词:醋酶基因;工程菌;细胞固定化;降解农药中图分雀号:X171文献标识码:A文章编号:10以卜石923(199)05-(抖61刁5班ghe脚以meacti讨tyofanenglnee此dbacteriaanddegradationofpesticidesbyinUnobilizedcdls·YAN、傲n-ehun‘,QIAOChuan一ln扩,zHOUXiao一tao3(1.Colle罗ofLifeSeiences,ShandongAgnculturalUniversity,Taian271018,China;2.InstitoteOfZology,ChineseAeademyofSeienees,Beijingl(X刃80,China;3.CollegeofLifeSeienees,PekingUniversity,Beijingl(X)871,〔为ina).ChinaenvironmentalSeience.1999,19(5):461一65Abstract:CulexPIPiensquinquefaseiatUs,ageneindueingresistancetoorganoPhosPhatePesticidewaselonedintoPlas而dPRL一439.ExPressionofrecombinantplas而dcontainingesterasegenewasdetected·AnengineeredbacteriumpossessinghighenzymeactivitywasobtainedandilnrnobiliZed.Assaysshowedthatmorethan9()%ofeitheracetofenate(7504anorg沥echioridepestieide)orPyre廿iroidswasdegradedbythein”nobilizedeellswithinonehour.Keywords:esterasegene:engineredbactena:imobilizedeell;degradatlonofpestieide固定化微生物处理废水是近10年发展起来的废水处理新技术[l1.由于可选择高浓度固定各种优势菌种,在含难降解有机物工业废水中的应用越来越受到重视,利用转基因微生物降解有机污染物更是研究热点[2l.农田长期过量施用农药,严重破坏了生态平衡,造成土壤、水质及大气污染,有毒物质也易被生物富集,使作物及食品中残留量毒性增加,给人、畜带来潜在危害.本研究所用抗性尖音库蚊五带亚种(CulexpiPiensq“inq“晌‘ciatus)的酷酶基因至少可扩增250倍,抗性倍数达500倍[31.本文利用该酷酶基因的表达产物可将农药降解而使其失去毒杀作用的机理,将抗性库蚊的醋酶基因克隆、在大肠杆菌中的表达以及表达产物酶活的提高和将该工程菌固定化后对有机氯农药75以、菊酷类农药(Deis)澳氰菊醋进行降解.结果表明,固定化的工程菌能高效地降解这两类农药.国内外尚未见到有关该酷酶基因表达产物的研究报道.材料和方法1.1材料1.1.1细菌与质粒大肠杆菌HB101,转化受体菌;大肠杆菌质粒pRL一439,抗性标记为Ampr,多克隆位点接受Bl一cDNA的插入,由中科院植物所施定基教授提供;大肠杆菌质粒pUclg一Bl,抗性标记为Ampr,目的基因,由法国蒙贝利埃大学MichelRaymond教授提供.1.1.2培养基LB培养基按文献[4]配制.1.1.3抗生素氨节青霉素(AmPr,amPicilhn).1.1.4主要酶制剂所用工具酶包括各种限制性内切酶、RNase、溶菌酶、DNA聚合酶I大片段、T4DNA连接酶、牛小肠碱性磷酸酶等均购自美国Promega公司.收稿日期:1998一12一21基金项目:国家自然科学基金资助项目(3968《X〕1);山东省自然科学基金资助项目(Y98D16仅抖)中国环境科学19卷1.2方法1.2.1DNA的操作质粒提取、限制性内切酶酶切反应、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的分离与回收、D