气相色谱技术在革兰氏阳性无芽孢厌氧杆菌鉴定中的应用

《现代仪器》二年·第一期气相色谱技术在革兰氏阳性无芽抱厌氧杆菌鉴定中的应用修淑丽熊德鑫梁明钟方虎‘谭立‘郑伟’解放军医院创伤中心研究室摘要使用气相色谱技术分析革兰氏阳性无芽袍厌氧杆菌的代谢产物,发现此技术在这类菌的菌属确定上有重要意义。一般来说,双歧杆菌其主要代谢产物是乙酸和乳酸,大致上比例为,而乳酸杆菌属菌种其主要代谢产物是乳酸,而乙酸产量仅为乳酸的产一左右。再通过生化性状鉴定,可进一步确定它们的菌种名称。关键词厌氧菌气相色谱乳酸和乙酸随着厌氧菌培养技术和方法的改进,已知厌氧菌是人类口腔和肠道菌群中的主要成员,尤其是革兰氏阳性无芽袍厌氧杆菌,包含了人类主要的生理性细菌—双歧杆菌属和乳杆菌属等。要研究菌群中各成员的相互关系,首先要对菌群中的厌氧菌进行系统的分类和鉴定。在氏系统细菌鉴定手册第九版,中,许多厌氧菌的分类和检索表都列有色谱分析其代谢产物的结果,有许多菌属它们在形态上包括革兰氏染色,甚至生化性状上都不能很好的鉴别,但是使用气相色谱技术分析菌的代谢产物就可以轻易地将它们区别开来。由此可知,气相色谱技术对于简化厌氧菌的分类和鉴定起了重要的作用,此类技术重复性好,分辨率也较高,目前广泛应用在微生物鉴定方面和厌氧菌感染研究中仁‘·‘·二二。材料和方法试剂乙酸、丁酸、异丁酸色谱纯天津化学试剂二厂乳酸分析纯,北京化学试剂厂甲醇色谱纯,天津市西华特种试剂厂氯仿、乙醚、硫酸分析纯,北京化学试剂厂仪器和操作条件仪器为。八色谱分析仪,色谱柱一柱检测器为柱温。、,进样口温度,检测器温度。载气为高纯氮气,流量切毫升分燃气为氢气,毫升分。助燃气为空气,流量毫升分。衍生物的制备和提取挥发性脂肪酸的提取取培养物毫升加正丁酸内标毫升共毫升至灭菌干燥螺旋管中,加人写硫酸毫升,摇匀后加人乙醚毫升,旋紧管盖,震摇分钟,之后〕离心分钟‘取上面醚层至另一灭菌试管中用于分析。非挥发性脂肪酸的提取取培养物毫升加硫酸毫升,并加甲醇毫升,置。〔、水浴箱中一的分钟,取出后震荡弓一分钟,加氯仿毫升,。。二、离心一分钟,取底部氯仿层至另一灭菌试管中用于分析。分析前的准备将待检菌株接种到一毫升培养基口中,经八型厌氧手套箱培养招小时后,用涂片染色法证实为纯菌后,按仁述方法进行八及八的代谢产物衍生物的制备和提取。作空白对照分析每批待检菌株时把同批制作的〔于空白培养基同样方法提取分八及入八以校正待检菌株脂肪酸的含量结果四株双歧杆菌和四株乳杆菌的代谢产物经气相色谱分析后,其代谢产物中乙酸和乳酸的一百分含量列于表中。带,者单位是空军航空医学研究所《现代仪器》二年·第一期表革兰氏阳性无芽抱厌扭杆菌代谢产物中乙酸和乳酸的百分比含编号菌株名称两歧双歧杆菌短双歧杆菌之青春双歧杆菌婴儿双歧杆菌嗜酸乳杆菌保加利亚乳杆菌干酪乳杆菌嗜酸乳杆菌乙酸乳酸。〕,部分菌株代谢产物的色谱分析图如下。厌氧杆菌在培养基中的代谢产物色谱分析图为菌株为菌株。峰为乙酸,蜂为乳酸峰为内标讨论应用气相色谱分析厌氧菌的代谢产物中短链脂肪酸已成为厌氧菌分类鉴定不可或缺的手段,这是因为厌氧菌中不少菌属和菌种,单纯以革兰氏染色观察菌的形态或进行生化性状的比较也不易将这些菌属或菌种区别开来,因此有学者认为庆氧菌的代谢产物的气相色谱分析是厌氧菌菌属确定的重要手段。比如说革兰氏阴性无芽胞厌氧杆菌中类杆菌和梭杆菌属就很难从形态和生化性状鉴别它们,同样革兰氏阳性无芽胞厌氧杆菌中双歧杆菌和乳酸杆菌它们都是革兰氏阳性的直杆菌,无芽胞,生化性状中有不少相近或相像,比如均酵解一些糖如葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖等产酸,因此,双歧杆菌和乳酸杆菌菌种的选育和鉴定存在一定困难。因此国外已把用气相色谱法分析厌氧菌载体外培养物中产生的脂肪酸及其他挥发性代谢产物作为常规细菌鉴定的一种手段阁,在培养基中双歧杆菌株以产生乙酸为主,乙酸和乳酸比例大致为一,如果菌株以产生乳酸为主,乙酸仅为乳酸产生的,至。,那么该菌株应确定为乳酸菌属的有关菌种。我们对八株细菌的气象色谱分析结果表明双歧杆菌代谢产物的乙酸量和乳酸量之比介于,之间乳酸菌的乙酸量仅占乳酸量的一写,印证了上述观点。因此对于革兰氏阳性无芽抱厌氧杆菌鉴定时,气相色谱分析菌的代谢产物确定其菌属提供了更为客观有效的证据,再结合检测其生化性状就可以进一步将这些细菌鉴定到种,可以克服革兰氏阳性无芽抱厌氧杆菌鉴定中面临的难题。参考文献周方等气相色谱法检出和鉴定厌氧菌的实用研究微生物学通报一·熊德鑫等厌氧菌检验手册,中国科学技术出版社页,一,,一一钟方虎谭立等裂解气相色谱分析厌氧菌中国化学会第十届分析与应用裂解学术会议论文集年月浙江台州一一矛飞袱一’、,‘‘〔’一一一百,找一一全一飞〔,、、足,飞一、只、、,,,、一、一工〕一。,一,、〔,’,一。‘,,几’飞。只、一一飞,·。、、,