RNA序列同源性分析与细菌系统分类鉴定

16srRNA序列同源性分析与细菌系统分类鉴定序列同源性分析与细菌系统分类鉴定焦振泉刘秀梅综述孟昭赫审校中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所(北京100050)摘要摘要本文介绍了16srRNA序列测定及同源性分析的方法,并阐述了其在细菌系统分类鉴定中的重要作用。关键词关键词16srRNA序列同源性分析细菌分类鉴定近10多年来，随着分子生物学理论和技术的迅速发展，特别是作为生物技术里程碑的聚合酶链反应(PCR)技术的出现及核酸测序技术的不断完善，产生了许多新的分类方法，如：质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、脉冲场凝胶电泳、PCR指纹图、rDNA指纹图、16srRNA序列分析等。它们主要是对细菌染色体进行直接的DNA分析或对染色体外的DNA片段进行分析，从遗传进化的角度去认识细菌，从分子水平进行分类与鉴定，使细菌的分类越来越科学和精确，特别是16srRNA序列分析方法的出现使细菌进化可以通过试验研究来证实。这是细菌分类史上的一次革命，必将使人们对生物进化及其与其它生物学科关系的认识更加深入。一、一、16srDNA的结构和性质的结构和性质16srRNA为原核生物核糖体中一种核糖体RNA。目前，在细菌的系统分类学研究中最有用的和最常用的分子钟是rRNA，其种类少，含量大(约占细菌RNA含量的80%)，分子大小适中，存在于所有的生物中，特别是其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。rRNA在大多数原核生物中都具有多个拷贝[1]，5s、16s和23srRNA的拷贝数相同[2]，16srRNA由于大小适中，约1.5kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术来较容易地得到其序列，故被细菌学家及分类学家所接受[3]。所以，“细菌系统学研究特设委员会”建议依据系统发育关系分类。通过对其序列的分析，可以判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近。细菌的16srRNA的可变区位点结构如下[4]：可变区(variableregion，V1～10)V1：61～106bpV2：121～240bpV3：436～500bpV4：588～671bpV5：734～754bpV6：829～857bpV7：990～1045bpV8：1118～1160bpV9：1240～1298bpV10：1410～1492bp恒定区(constantregion)可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，所以，可以利用恒定区序列设计引物将16srRNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。但较其它方法而言，16srRNA序列测定分析更适用于确定属及属以上分类单位的亲缘关系。216srRNA序列测定与分析方法序列测定与分析方法对不同细菌的16srRNA序列进行同源性比较分析是推断细菌的系统发育及进化关系的一个重要方法。这些序列主要通过寡核苷酸编目(oligonucleotidecataloging)、克隆序列的测定、反转录直接测序、对PCR扩增产物的直接测序等方法获得。2.1寡核苷酸编目寡核苷酸编目采用已知碱基专一性的核酸酶(如RNaseT1)彻底消化RNA，消化产物用层析和电泳双向分离，放射自显影记录结果得初级指纹图，再对初级指纹图上的每一个点进行序列分析，最后依字母顺序和链的长短将所试rRNA的所有寡核苷酸列出一个目录式清单进行编目，并据此计算不同rRNA间的相似数(SAB)SAB=2NAB/(NA+NB)NA、NB分别为两样品中各自具有的长度为L个核苷酸以上的寡核苷酸残基数目，NAB是两样品中共同具有的寡核苷酸残基数最后用SAB构建系统发育树[5]。Woese等[6]利用RNaseT1对16srRNA进行寡核苷酸编目，建立了原核生物系统发育的总体框架。寡核苷酸编目只利用了rRNA上40%的信息，现今，由于核酸快速测定技术的发展，该法已被其它的序列分析法所取代。2.2其它几种方法这些方法其它几种方法这些方法主要是利用16srRNA恒定区序列特别保守的特点，在恒定区上设计引物，将细菌16srRNA扩增出来，读取16srRNA序列，对不同细菌的16srRNA进行同源性比较及分析。目前比较通用的几种16srRNAPCR扩增引物见附表[7]。附表目前比较通用的几种16srRNAPCR扩增引物1引物缩写：f：正向r：反向D：远端P：近端。带f的包含ECoRⅠ和SalⅠ的位点;r包含HindⅢ和BamHⅠ和XmalⅠ识别序列;反向引物产生rRNA的互补序列;rP1、rP2、rP3除从3’端开始的第17个碱基不同外全部相同。2所有引物序列方向都从5’～3’，连接序列包含用小写字母写的克隆用酶切位点;由于细菌染色体上的rRNA基因以复数存在(约10个左右)[8]，当译读PCR产物的直接序列时，复数拷贝如不全是相同