应用PCR-DGGE研究饮用水中微生物的多样性

第40卷第3期南开大学学报(自然科学版)V01．40№32007年6月Aff口．sff已升fi口，—“，”Ⅳ口f“，·盘Zi“，行U行iP，丐if口￡isⅣ口行量口iP竹sfsJun．2007文章编号：0465—7942(2007)03一0092一05应用PCR—DGGE研究饮用水中微生物的多样性吴卿，赵新华(1．天津大学环境科学与工程学院，天津300072)摘要：变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)在微生物生态学领域有着广泛的应用．应用冻融法直接提取不同饮用水水样微生物基因组DNA，选择细菌通用性引物EUBf。。aGC和EUBr，38t，对包括细菌V6、7及8区的16SrRNA基因进行扩增，经变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行分离后，得到不同数目且分离效果较好的电泳条带．结果表明，DGGE能够对饮用水样品中的不同微生物的16SrRNA基因的DNA扩增片段进行分离，为进一步对这些DNA片段回收和测序奠定了基础．不同取样点饮用水样品中虽然存在特异菌，但各取样点水样中的优势菌相同．从南北方两个城市水样微生物组成来看，优势菌群基本一致，但南方某市的饮用水微生物学相关指标的测定结果明显好于北方某市，优势菌的数量和微生物种类明显少于北方某市．关键词：饮用水}变性梯度凝胶电泳(DGGE)；16SrRNA，微生物多样性中图分类号：X172文献标识码：AO引言控制饮用水的微生物学水质是很重要的，由于微生物可以在饮用水中存活并繁殖扩散，造成了饮用水的微生物或病原菌污染．因此及时准确的为控制饮用水微生物学水质提供充分可靠的信息是很必要的．饮用水中微生物的鉴定对于在突发事件时分析判断产生有害产物的原因很重要．这样的微生物信息对于产物或过程的微生物污染源也是很重要的．越来越多的研究表明，饮用水样品中只有不到1％的微生物可经实验室培养口]．因此，用传统培养方法研究微生物群落，不能反映环境的真实情况．近年来，一些分子生物学的方法已经应用于自然状态的样品的研究中[2~4]．这些分子生物学技术无需对微生物进行分离即可鉴定微生物的多样性，特别是变性梯度凝胶电泳(DGGE，denaturinggradientgelelectrophoresis)技术更是一个有力的工具．由于16SrRNA基因的功能相对稳定，具有包含信息量较多、存在范围广等特点，使16SrRNA的研究得到广泛关注，以rRNA序列作为区分微生物的原则已得到普遍承认嘲，并被广泛地应用于进化、形态和生态研究‰引．在利用DGGE进行微生物多样性研究中，关键在于对样品中所有微生物群体16SrRNA基因(16SrDNA片段)进行有效扩增．通过对16SrRNA的编码基因特异PCR(polymerasechainreaction)扩增，并利用DGGE对扩增片段进行电泳分析，具有相同大小但不同碱基序列的DNA片段可以被分离开来．这些方法已被引入分子微生物生态领域，用以研究自然状态的微生物群体的遗传的多样性和确定群体成员的系统发生关系．自1993年Muzyer首次将该方法用于微生物生态的研究以来，在国外一直得到比较广泛的应用．国内已见有关该方法在DNA突变和PCR克隆突变率检测中的应用，但在微生物生态学方面的研究还处于初步探索阶段，而将该方法应用于饮用水中微生物组成多样性的研究还未见相关报道．本研究应用DGGE法对北方某市市区饮用水配水管网中选定的9个点和南方某市市区饮用水配水管网中7个点所取水样进行分析，对各个监测点采集水样中的细菌多样性进行了初步研究．研究表明PCR—DGGE方法可以用于饮用水中微生物群体组成的研究．收稿日期：2005一04一01基金项目：国家“十五”重大科技专项(2002AA601120)；国家自然科学基金(50478086)作者简介：吴卿(1976一)，女，河北石家庄人，博士研究生．万方数据本页已使用福昕阅读器进行编辑。福昕软件(C)2005-2009，版权所有，仅供试用。第3期吴卿等：应用PCR—DGGE研究饮用水中微生物的多样性·93·1材料与方法1．1水样的采集本研究涉及两个实验小区，在北方某市实验小区共选取9个取样点，其中包括管网入口点(1、9号点)、沿程点(3、7、8号点)和末梢点(2、4、5号点)，另外还包括一个高层水箱点(6号点)．南方某市实验小区共选取7个取样点包括管网沿程点(1、2、3、4、5号点)、小区人口点(6号点)及管网末梢点(7号点)．取样均按照标准方法进行，水样采集后尽快送回实验室进行实验，按照国家标准方法对水样进行测定‘引．．1．2实验仪器实验用PCR仪为德国Eppendorf5331型梯度PCR仪、离心机为德国Eppendorf5810R高速离心机，电泳仪为美国CBS公司水平及DGGE电泳仪，抽滤装置为PaU真空抽滤系统．总余氯采用HACH46700—001型便携余氯