采用厌氧培养技术分离纯化光合细菌

采用Hungate厌氛培养技术分离纯化光合细菌摘共利用Hung.te厌氧培养技术,克服传统分离光合细菌方法的不足,是一种快速、准确、简便地分离纯化光合细菌的方法。关桩词厌氧培养技术;光合细菌;纯化目前,分离纯化光合细菌的方法甚多,但常用的几种方法存在着一些缺点:VanNiel创立的“搅动”琼脂法田,在操作过程中琼脂培养甚很快凝固,给稀释带来困难;KoHTpaO倪Ba分离纯化法山易产生气泡,挑取单菌落时容易污染;厌氧光照平板法国较效琐,且易使琼脂脱落或培养时间较长而造成琼脂干缩。为了改进光合细菌的分离纯化方法,我们借助Hungote厌权培养技术闭收到了较好的效果,现将有关实脸方法和结果介绍如下。:材料与方法(一)材料Hung血te厌级培养装t(图珑珑珑兰兰多留留口口口图1Hun‘at。厌暇培养装里示意图O氮气钢瓶À抓气钢瓶。石英玻管(或耐高温普通玻璐管)”丫3,Omm两端收编为8火劝二m,内胶3/,休积的铜属¼石棉加热带¾变压器控制加热带沮度。带有多个出气株胶管的多孔玻管O滚甘机除上述装置外还需注射器、毛细管(粗的一端塞有棉花,细的一端弯成9。”)、带异丁烯橡皮塞和中间有小孔耐高压塑料螺旋盖的厌氧管。(二)方法与步骤1.高浓度无氧气体的制备:接通电源,变压器输出电压90一100V,电压从零逐渐上升到10OV,加热铜屑柱20一30分钟,打开氮气总阀,调节分压阀,得到平稳的氮气气流。若铜屑已被氧化成黑色则接氢气进行还原至出现纯铜铮亮色时换上氮气流使用。2.无氧培养基的制备:固体培养基(肠):MgSO。0·059,KHZPO一0059,蛋白陈0.19,糊精0.59,琼脂1.89,FeSO;微量。若样品取自海水则加3关的N:cl。在圆底烧瓶中加人不超过烧瓶体积223的固体培养基,再加人0.1铸的刃天青溶液0.2肠。标好刻度后加人培养基体积20外的蒸馏水。加热沸腾,通人无氧氮气。根据所欲分离不同的光合细菌(红螺菌科碑7.0;着色菌科PHS.。一8.5;绿硫菌科pH7.3)用气0%的NaZCO,和0.INH:PO;调pH。待刃天青指示剂还原为无色时,分装到厌氧管中。分装时先往空管中通无氧氮气1一2分钟后,用注射器取4.,ml培养基迅速移人厌氧管中,继续通氮气,刃天青指示剂保持无色。在抽针的同时塞紧异丁烯胶塞,螺旋盖拧紧。湿热灭菌Ikg/e时20一30分钟。3.光合细菌的分离及纯化1,,2年一9(呼)微生物学通报一241-(l)光合细菌的分离:将溶化好的装有固休培养基的厌氧管置于45一50℃水浴中。分离着色菌科细菌时先注人1.,%的过滤除菌无氧Na:s·gH:00一5二l,然后取0.lml稀释至10一,一10一‘的富集液用注射器注人,轻摇,平放于滚管机的滚轴与支托点之间,启动滚管机,使厌氧管匀速转动。由于滚轴带动水的冷却作用,培养基在厌氧管壁上形成均匀透明的薄膜。置1000一Z000Lx,28℃培养3一4天可长出单菌落。(z)菌落的转移和纯化:由于光合细菌含有特殊的色素,因此易于辨认。将两个氮气流针头在酒精灯上灭菌,打开欲取出菌落的厌氧管塞和装有液体培养基团的厌氧管塞的同时插人液体培养基。28℃,2000Lx培养至液体管出现光合细菌特有的颜色。镜检,看液体管中菌的形态是否单一,否则重复以上过程继续分离。图2滚管法分离的光合细菌结果与讨论1.该方法操作简便、迅速,适于光照,分离效率高,菌落易于辨认,易挑取,操作过程不易污染等优点(图2)。2.该方法的整个操作过程都在无氧状态下,满足严格厌氧的绿硫菌科、着色菌科的要求,克服了以往分离方法中以单一常见菌种为主的现象。3.培养基中加人刃天青,当氧化还原电位较高时为紫色或粉红色(视州而定),氧化还原电位低于一42mv时则为无色,颜色变化明显且对菌的生长没有影响,可以直观地判断是否处于无氧状态。4.在培养基中加入N朴S·,H尹,不仅可以进一步降低氧化还原电位,同时也是光合细菌的光合电子供体。液体培养着色菌科和绿硫菌科的细菌,开始培养基无色,随着生长52一被利用,变成粉红色,这时要补充N丸s·gH刃溶液。,.以上是分离纯化一般光合细菌普遍适用的方法,可根据欲分离菌的特点简化上述方法。,考文献1.VanNi.ICB:Ar‘几·MICrobiol·,3:l,1931·2.KoHpoo6eaa,E.H.:中oToeoHTe,“py幻哑BaKTeP“H,H3且一BO,AHeeepMoeKo”a.、,63·3.〔日〕土壤微生物研究会编:土壤微生物实验法,p.3“.东京株式会社养贤堂,1,7,年。今.HungateRE:Arolltubemethodforeultivationof.trietanaerobe一,Vol.3B,AeademicPre*5Ine二NewYork.PP.117一132,l,‘,.,.郑士民等