一株好氧反硝化菌的特征及系统进化分析

第25卷第1期2004年1月华侨大学学报(自然科学版)JournalofHuaqiaoUniversity(NaturalScience)Vo1．25No．1Jan．2004文章编号1000—5013(2004)Ol一0075—04一株好氧反硝化茵的特征及系统进化分析张光亚①方柏山①闵航②陈美慈②(①华侨大学材料科学与工程学院，福建泉州362011：②浙江大学生命科学学院，浙江杭州310029)摘要从土壤中分离出一株好氧反硝化菌，名为菌株HN．分离菌株呈革兰氏染色阳性，为球状或杆状，菌落颜色显橙红色．该菌株以硝酸钠为氮源时，进行好氧反硝化作用．能以乙酰胺为唯一碳源和氮源进行生长．它的部分长度16SrDNA序列分析表明，分离菌株HN与Rhodococcusruber的16SrDNA序列具有99相似性．实验采用PHYLIP程序对该菌株与报道菌进行系统发育进化分析．关键词好氧反硝化菌，Rhodococcussp．HN，16SrDNA序列．系统进化分析中图分类号Q933：Q93—331文献标识码A脱氮是近年来废水处理研究的重要课题，而生物脱氮又被认为是目前废水脱氮中经济有效的方法之一．传统生物脱氮工艺将硝化和反硝化作为两个相互独立的阶段，使二者在时间和空间上分开．即硝化反应发生在好氧条件下，反硝化反应则发生在严格的缺氧或厌氧条件下．近年来，国内外的不少研究和报道已能充分证明，反硝化可发生在有氧条件下，即存在好氧反硝化n．在许多实际运行中的好氧硝化池中，也常常发现有309／6的总氮损失j．这种好氧反硝化过程是由所谓的好氧反硝化菌引起的．这些好氧反硝化细菌如粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)、泛养硫球菌(Thiosphaerapantotropha)，现更名为脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)j，能同时利用氧和硝酸作为电子受体以获得高生长率．利用好氧反硝化菌发展好氧脱氮技术，具有3个优点．(1)使硝化／反硝化反应在同一个反应器中进行，可以大大减少占地面积和建设资金．(2)使用好氧反硝化细菌，可以减少处理过程中加入调节系统pH的化学物质，降低成本．(3)在处理过程中，好氧反硝化菌更容易控制．本文从土壤中经分离和纯化，得到一株与迄今所报道的好氧反硝化菌均不相同的好氧反硝化菌．根据其生理生化性状和部分长度的16SrDNA序列，确定了分离菌株的分类学和系统发育地位．1材料与方法1．1异养型硝化细菌的分离1．1．1培养基组成2．0g乙酰胺，1．6gNaOH，8．2gKH2PC4，0．5gMgSO4·7HO，0．5gKC1，0．5mgCuSO4·5H2O，0．5mgCaSO4·2H2O，0．5mgZnSO4·7H2O，0．5mgFeC13·6H2O，1．0LH2O，pH值为7．0．1．1．2富集分离取土样于上述培养基中，经富集并在平板上划线分离．然后，分别挑取单菌落于液体培养基中，检测液体中亚硝酸含量，选取产亚硝酸较强的一株分离物进一步试验．1．2碳源和氮源试验培养基氮源改为质量分数为0．002的硫酸铵，碳源分别为乙酸钠、甲酸钠、苹果酸，葡萄糖、衣康酸、乙酰胺、酵母膏和蛋白胨．氮源试验时，碳源改为乙酸钠，所用氮源是质量分数都为0．002的乙酰胺、硫酸铵、硝酸钠、亚硝酸钠、尿素和氨基乙酸．培养6Oh后，测定菌体生长量(试验重复3次)．‘收稿日期2003-08—26作者简介张光亚(1975一)．男，硕士，助教，主要从事生物信息学与分子生态学的研究．E-mail：zhgyghh@hqu．edu．cn基金项目浙江省自然科学基金资助项目(399214)；华侨大学科研基金资助项目(03HZR7)⋯●_卜r’维普资讯http://www.cqvip.com华侨大学学报(自然科学版)1．3分离菌株反硝化活性以质量分数为0．002的硝酸钠为唯一的氮源，以乙酸钠为碳源，培养基煮沸5min后取20mL放入120mL的血清瓶中．菌株活化后接种于该液体培养基中，每隔一定时间测定菌体生长量和亚硝酸量，试验重复3次．1．4好氧反硝化细菌的鉴定1．4．1显微摄影用带拍摄装置的OlympusBH一2型光学显微镜拍摄．菌落中的菌体用接种针挑取后涂抹在载玻片上，滴加i／4滴蒸馏水，加盖盖玻片，用相差拍摄．i．4．216SrDNA的PCR扩增和测序从平板中直接挑取一环菌体，加到100L的重蒸馏水中，旋涡混匀后．沸水浴7min．在离心机(12000r·rnin)上离心5min．上清液直接用于PCR扩增模板．用于16SrDNAPCR反应的引物为一对通用引物．即正向引物为BSF8／20(5-AGAGTTTGArrCCTGGCTCAG-3)，反向引物为BSR1541／2o(5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA一3)．引物由上海生工生物工程技术服务