嗜热厌氧纤维素降解细菌的分离、鉴定及其系统发育分析 (1)

42卷2期2002年4月微生物学报AetaM／crob~tog／caSinieaV01．42No．2April2002嗜热厌氧纤维素降解细菌的分离、鉴定及其系统发育分析韩妊嚼1司舵眷美慈赵字华(浙江大学生命科学学院杭州310029)摘要：利用纤维索降解细菌和纤维素粘跗的方法分别从新鲜牛粪、高温堆肥和率实验室保存的纤维素降解富集物中分离得到4株嗜热厌氧纤维素降解细菌。分离菌株为革兰氏染色阴性直的或稍弯曲杆菌，菌体大小为0．4一O．6m×3gun一15m，严格厌氧．不还原硫酸盐，蝣成芽抱多数芽孢着生于菌体顶端。分离菌株能利用纤维素滤纸、纤维素粉whatmanCf'lI、微品纤维素、纤维索粉MN300和未经处理的玉米秆芯、甘蔗渣、水稻秸杆。分离菌株在pH62—89、温度45一65℃范围内利用纤维素，最适pH为70—75，最适温度为5560．发酵纤维素产生己醇、乙酸、H和COz。分离菌株还可利用纤维二糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、山梨醇作为碳谭。部分长度的16SrDNA序列分析表明．分离菌株EVAI与Clostriditurtthermocellura具有998％相似性关键词：纤维素降解嗜热厌氧细菌，16Sr1)NA，系统发育分析中图分类号：Q939文献标识码：A文章编号：0001—6209(2002l02—0138．07纤维素是自然界中最丰富的可再生资源。自然界存在着许多种能降解纤维素的嗜热厌氧细菌．该类细菌在高温厌氧条件下具有较强的纤维素降解能力和热稳定性的纤维素酶，因此对人们进一步了解纤维素微生物降解机理、自然界物质转化和纤维素资源的最优化利用具有重大的理论意义和潜在的应用价值。多数嗜热厌氧纤维素降解细菌在纤维素降解过程中对纤维素具有强烈的粘附作用⋯。根据纤维素降解细菌对纤维素的牯附作用，用不溶性纤维素粉直接滚管的方法成功分离得到4株嗜热厌氧纤维素降解细菌，并对分离菌株直接转化纤维素产生乙醇的特性，对纤维素的粘附作用及纤维素酶的部分特性进行了研究。本文报道分离菌株的微生物学特性和基于16SrDNA序列的系统发育分析。1材料和方法1．1分离源和分离纯化方法EVA1菌株来源于新鲜牛粪(采自浙江大学华家池校区奶牛场)；EVA2和EVA3菌株来源于高温堆肥(采自浙江大学华家池校区奶牛场)；EVA4菌株从本实验室保存的一个纤维素降解富集物中纯化得到。培养基配方，分离和纯化的步骤见文献[2，3，4]。奉研究为浙江省自然科学基金项目c396070)作者简介：韩如晒(1972一)．男．浙江省象山县人，现为浙江大学在读博士生，主要研究方向为环境散生物学和有机污染物的生物降解收稿日期：200I4)6．28．俸回日期：2(Ol—II一22维普资讯http://www.cqvip.com2期韩如哂等：嗜热厌氧纤维素降解细菌的分离、鉴定及其系统发育分析1．2菌株测量用OlympusCH型光学显微镜直接测量菌体大小。1．3显微摄影用带拍摄装置的OlympusBH一2型光学显微镜直接拍摄纤维素粉培养基中形成的透明圈和纤维二糖培养基中生长的菌落；菌落中的菌体用接种针挑取后涂抹在载玻片上，滴加1／4滴蒸馏水，加盖盖玻片，用相差拍摄；液培状态的菌体直接拍摄相差照片。1．4电镜研究将分离菌株纤维二糖液体培养基48h培养物负染，纤维二糖琼脂培养基生长96h的菌落制成超薄切片后用JEM一1200EX型透射电镜观测和拍摄。1．5细菌生长量测定纤维二糖和葡萄糖为碳源时直接利用装有10mL培养基的1．5cmx15cm厌氧试管在752型分光光度计上测定波长为610nm时的OD值；纤维素滤纸为碳源时1．5cm×15cm厌氧试管装有10mL基础培养基和滤纸条(长度小于3cm，以免挡住光路)，测定方法如下：滤纸降解并溃烂之前，可以直接利用厌氧试管测定OD值；滤纸溃烂并软缩于试管底部后，则采用1000r／rain离心5min，使培养液中的纤维片段沉淀下来后测定OD值。每12h测定1次1．6最适温度和最适pH测定接种至纤维素滤纸培养基后分别放置在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下培养，观察纤维素滤纸降解配制不同pH值的纤维素滤纸培养基，使之pH值在5．5和9．0之间，约每隔03设定1个处理，接种后57℃培养5d后测定纤维素降解。1．7碳源利用和产物测定在基础培养基中加入1％糖类作为碳源，纤维素为碳源培养至纤维素开始溃烂时的培养物作为接种物，接种量为1％，57~C培养7～15d，目测培养液浊度。纤维素降解率和乙醇测定方法见文献[3]，和CO测定见文献[5]。有机酸测定见文献[5]。还原糖浓度测定见文献[6]。1．816SrDNA的PCR扩增和序列分析供试菌株用纤维二糖培养基培养48h，吸取1mL菌液于eppendod管中，12000r／min离心1min，弃上清，